Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
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英語の編集を博士 M. コーキンズを感謝いたします。この作品は、長庚記念病院 (CMRPD1F0482)、長庚大学、健康加齢研究センター (EMRPD1G0171) と省の科学と技術 (105-2320-B-182-012-MY2) によって支持されました。

実験動物を使用するすべてのメソッドに記載は、動物介護制度や長庚大学 (CGU 13-014) の使用委員会 (IACUC) によって承認されました。
1. 実験的ラットの腰部後根神経節を収集します。
<ol><li>腰椎の DRG コレクションの 3 週齢 Sprague-dawley (SD) ラットに 2 を使用します。 注: 以上 4 週齢ラットから収集した DRG ニューロンは、記載の培養条件下でよく成長はありません。</li>
...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

本稿ではラット腰椎のコレクション、酵素分解、文化紹介 DRG。NGF 神経栄養サポート、DRG ニューロンの軸索は細胞播種後 3 日以内延長。拡張の軸索細胞で細胞細胞体で合成され、軸索線維に沿って運ばれる CGRP タンパク質染色後明確に観測される.日以内のニューロンを囲むこれらの分割のグリア細胞をできるように、拡張も衛星細胞のプロセス。このプロトコルにより成長したプライマリの...

感覚ニューロンの細胞体は後根神経節内に含まれます。これらのニューロンは擬似単極、末梢組織と中枢神経系を支配します。感覚ニューロンの末梢神経終末は、筋肉、皮膚、内臓器官や骨、他の組織.の間であります。体性感覚1,の2つの昇順経路を介して脳に転送される脊髄後角、および信号の終末神経の末梢の感覚信号します。体性感覚を可能に (すなわちタッチ、痛み、および熱感覚) を感じ、知覚運動と空間的な向き (固有受容感覚)1,の3体。4 がある骨格筋、皮膚の受容に応答グループ II (a β) 繊維の感覚に対応し、グループ III (Aδ) (核内局在) 繊維と痛みに応答グループ V (C) 繊維を含むプライマリの求心性軸索のサブクラス群と温度。C 線維のみ、残りが異なる度に有髄髄、おりません。
侵害受容器は、組織の損傷の可能性を運ぶ侵害刺激 (機械的、熱的、化学的刺激) によって活性化される第一次感覚ニューロンです。これらのニューロンは、Aδ 有髄線維と無髄の C 線維1,4で構成されます。Aδ 繊維エクスプレスの SP、CGRP、神経成長因子 (NGF 受容体 trkA) 受容体C 線維は、ペプチドおよび非ペプチド作動性の C 線維に分類されます。その一方で、非ペプチド作動性 C 線維はグリア由来神経栄養因子 (GDNF、RET、GFR 受容体)、isolectin、IB4 と ATP 依存性イオン チャネルのサブタイプ (P2X3)5,6、7のための受容器を表現します。侵害受容器のイオン チャネルの発現によって区別、神経栄養因子による活性化サイトカイン、神経ペプチド、ATP、または他の化学化合物8することができます。刺激、CGRP、SP、グルタミン酸などの神経伝達物質は、侵害受容性信号2を送信する脊髄後角における感覚ニューロンの端末からリリースされるかもしれない。DRG はだけニューロンから成るとはありませんが、また衛星グリア細胞を含みます。衛星細胞感覚ニューロンを囲む、機械的および代謝サポート9,10。興味深いことに、痛み感覚11の調節に DRG 衛星グリア細胞が侵されることを示す証拠の成長するボディがあります。
感覚ニューロンは最も頻繁に第一次神経細胞12を使用、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質放出の研究に利用されているが報告されています。神経の開発、炎症性疼痛、神経因性疼痛、(かゆみ) のような皮膚感覚軸索伸長12,13,14,15の細胞メカニズムを探るにもよく使用されます。DRG 初代培養は、実験科目では実行できない研究を実行する単一または複数のセルの生化学的変化を評価するために解離ニューロンとして培養することができます。最近、後根神経節が大きくトランスレーショナルリサーチ16に恩恵を受ける可能性があります人間の臓器提供者から養殖に成功しました。その一方で、後根神経節外植片として感覚ニューロンは培養も。DRG 植ニューロン、シュワン細胞と衛星グリア細胞を含む元の組織構造を維持、神経および非神経細胞17間の相互作用の研究に特に有用です。DRG 初代培養は、2.5 h の内で簡単に用意できます。細胞の組成と性質は後根神経節、ソースの反射率の高い、実験の要求に応じて特定後根神経節 (腰部や胸部の DRG) を収集できるよう。胎児・新生児の DRG ニューロンの文化必要軸索伸長を誘発して生き残るために NGF が大人ニューロンの文化メディア12,17に神経栄養因子の添加を必要としません。ND7/23 と F11、実験動物の使用を必要としないなどの市販の DRG ハイブリドーマ細胞株もあります。ただし、一時的な受容器の潜在的な陽イオンの欠如チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) 式 (小さな侵害受容ニューロンの重要なマーカー) と不適合遺伝子発現プロファイルの制限、アプリケーション18。最近では、行は、ラット (50B11)19から派生されている不死の後根神経節神経細胞およびマウス (MED17.11)20に適しているはターゲティング研究の高スループット画面で使用します。しかし、これらの細胞株の遺伝子発現はまだ実行します。したがって、感覚ニューロンへこれらの不死化細胞の比較検証実験はまだ進行中です。
NPFFR2 は、後根神経節で合成、脊髄後角21の感覚神経終末に移行します。この記事で私たちは腰部後根神経節細胞を培養し、CGRP と SP の神経伝達物質の放出を誘発する NPFFR2 のアゴニストとそれらを扱うのためのプロトコルを提供します。NPFFR2 への依存は、NPFFR2 小さい干渉 RNA (siRNA) 培養後根神経節細胞にトランスフェクション可能性がありますを使用してさらにテストされます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

後根神経節 (DRG) では、感覚ニューロンの細胞体が含まれています。ニューロンのこのタイプは、皮膚、筋肉、内臓、中枢神経系の脊髄後角などの末梢組織を支配する 2 つの軸索と、擬似単極です。感覚ニューロンは、体性感覚、タッチ、痛み、熱、および自己感応の感覚を送信します。したがって、DRG 初代培養は、侵害受容の分子機構、感覚ニューロンと神経系の発達の生理機能を研究に活躍しています。培養神経細胞は、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質のリリース、またはカルシウム イメージングを含む研究で適用できます。DRG 初代培養、科学者が単一の生化学の変化を監視する解離の DRG ニューロンの文化や生体内で実験に関連付けられている複数のセルは、多くの制約を克服します。市販に比べて利用 DRG ハイブリドーマ細胞不死化後根神経節神経細胞、組成や一次電池の特性より組織の感覚ニューロンに似ています。ただし、1 つの動物から分離できる培養後根神経節細胞の数が限られたため薬物標的の探索のハイスループット画面を実行することは困難です。現在の記事では、DRG のコレクションおよび文化のための手順を示します。さらに、FF の神経ペプチド受容体 2 型のアゴニストと後根神経節細胞 (カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CRGP) と P 物質 (SP)) ペプチド神経伝達物質の放出を誘発する (NPFFR2) の治療を紹介します。

24 ウェル プレートで培養ラット腰椎 DRG ニューロンは、グリア細胞の増殖を抑制する追加 Ara C と NGF 神経成長をサポートするための培養培地で栽培されました。生活の形態後根神経節細胞が観察されました。図 3に示すように、単一ニューロンの細胞体は日 1 皿の下部に取り付け、観測用に選択されました。軸索の伸長は 1-3 日目から監視されま...

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2 刺激を入力後、神経伝達物質の放出を検出するための腰部後根神経節文化の使用を示します。

伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

この方法は、周辺のノシセプションなどの感覚研究分野の主要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、生理学的状態に最もシミュレートするモデルを用いて感覚ニューロンの細胞機構を調査することです。2〜3週齢のラットのトランクから腰椎の底根神経節を収集します。脊柱の側面に沿って2つのカットを行い、腰椎のrostralの範囲をマークするために1つの横切りを行います。次に、骨切断鉗子を使用して背骨の背部筋肉を取り除きます。次に、脊椎の背骨部分を取り除き、脊髄を露出する。その後、解剖はさみと鉗子を使用して脊髄を取り除きます。最後のリブから椎骨を数えることによって腰部DRGを識別します。この図は、椎骨の位置を示しています。マイクロハサミを使用して、L1からL6までの12個の両側腰椎DRGを収集します。培養物の純度を向上させるために、付属の神経線維を除去する。各腰椎DRGを2ミリリットルの氷冷血清フリー培地を含む35ミリメートル培養皿に移します。DRG含有35ミリメートル皿を層状フードに移し、ピペットで3回無血清培地でDRGを洗浄します。滅菌用ピンセットを使用して、2ミリリットルの無菌コラゲナーゼタイプ1Aを含む新しい35ミリメートル培養皿にDRGを移動させます。コラゲナーゼ溶液中に37°Cの組織培養インキュベーターに30分間組織を入れ、細胞の解離を開始する。インキュベーションに続いて、コラゲラーゼ溶液を取り出し、ハンクのバランスのとれた塩溶液の2ミリリットルでDRGを3回洗浄します。次に、プリウォーム0.05%トリプシンEDTAを2ミリリットル加え、前のようにインキュベーターでDRGを30分間消化します。消化後、ガラスピペットを使用して、DRG含有溶液の2ミリリットルを15ミリリットルの遠心管に移します。DRGはガラスピペットにくっつくかもしれないので、このステップは注意して行われるべきです。実際の損失は、ガラスピペットのテーパー端にDRG含有溶液を保持し、遠心管にゆっくりと一時停止することなく溶液を移すことによって回避することができます。次に、摂氏4度で5分間Gの290倍の溶液を遠心分離する。遠心分離後、上清を取り除き、さらに2ミリリットルの無血清培地を加えてDRGを再中断します。洗浄を2回繰り返し、2ミリリットルのプリウォーム培養培地を用いて、最終遠心分離後に組織を再懸濁する。以前に準備した無菌炎研磨ピペットを使用して、DRGを約60回手動でトリチュレートします。次に、CO2インキュベーターから、1ウェルあたり1ミリリットルの培養培地を含むポリL-リジン被覆24ウェルプレートを取り除く。インキュベートされた培養液を皿から吸引する。1匹のラットから4つの井戸にDRG細胞を播種する。これは、ウェルあたり約500,000細胞の播種密度を与えます。翌日、培養培地を10マイクロモルアラク、1ミリリットルNGFあたり100ナノグラムを添加した培地に置き換える。細胞めっき後3日目に、培地をプレウォームド無血清培地の0.5ミリリットルに変更し、1時間インキュベートする。インキュベーション中に、RNaseフリー水1マイクロリットルに50ミリモルのsiRNAをトランスフェクションあたり12.5マイクロリットルの無血清培地に添加します。次いで、トランスフェクション試薬のピペット2.5マイクロリットルを、トランスフェクションごとに10マイクロリットルの無血清培地に入った。両方の溶液をピペットで混合し、この混合トランスフェクション溶液を室温で10分間インキュベートします。10分後、トランスフェクション溶液をDRG含有24ウェルプレートのウェルに加え、軽く振って混ぜます。6時間のインキュベーションの後、20%FBS、10マイクロモルアラC、および1ミリリットルNGFあたり100ナノグラムの培養培地を細胞の各ウェルに加えます。最後に、DRGを37°CのCO2インキュベーターでさらに66時間インキュベーターでインキュベートします。めっき後6日目、およびsiRNAトランスフェクションの72時間後に、培地を200マイクロリットルの無血清培地に変更する。30分間のインキュベーションの後、1マイクロリットルの刺激化学物質を加え、ピペットで軽く混ぜます。NPFFR2アゴニスト、dNPAおよび対応する車両がここで使用されます。必要な期間インキュベートした後、培養皿から培養液を回収し、5000倍Gで5分間5分間、摂氏4度で遠心分離機を回収し、懸濁した不純物を除去する。遠心分離から上清を収集し、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水で希釈します。市販の酵素免疫測定キットを用いて神経伝達物質のレベルをアッセイする。1日目には、矢印で示された単一のニューロンの細胞体が皿の底に取り付けられました。矢印で示されたグリア細胞も存在する。グリア細胞は、2日目に感覚ニューロンの細胞体を取り囲むプロセスを複製し、拡張し、3日目にさらに顕著であったプロセスである。別の培養において、CGRPタンパク質を染色し、ニューロンの形状を明らかにした。CGRPタンパク質染色は、感覚ニューロンの細胞質および軸索に現れる。ニューロンとグリア細胞の核形態は、DAPIで染色すると異なります。ニューロンはグリア細胞よりも大きく、より丸みを帯びた核を有する。対照的に、グリアの核は、より楕円形である。一度習得すると、この技術は、それが正常に実行されている場合、2時間半で行うことができます。このビデオを見た後、あなたは、裏根神経節を解剖し、培養する方法をよく理解し、基礎となる生理機能を調査するためのツールとして使用する必要があります。プライマリセルを使用することは、通常の細胞ラインで作業するよりもはるかに難しい場合があり、穏やかなことが常にこれらの手順を実行する際に最善の方法であることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

イムノパンニングによる成体マウス背根神経節培養の濃縮

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...