Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Vi takker Dr. M. Calkins for engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, sunn aldring Research Center (EMRPD1G0171) og departementet for vitenskap og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).

Alle metodene som er beskrevet her, og som bruker forsøksdyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruke Committee (IACUC) av Chang Gung University (CGU 13-014).
1. samle lumbale DRG fra Experimental rotter
<ol><li>Bruk 2 til 3 uke gamle Sprague-Dawley (SD) rotter lumbale DRG samling. Merk: DRG neurons samlet fra rotter over 4 uker gammel vokser ikke godt under kultur betingelsene beskrevet her.</li>
	<li>Sterilisere alle kirurgiske instrumenter i en autoklav.</li>
	<li>Bedøve ...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

Denne artikkel, vi viser innsamling, enzym-dissosiasjon og kultur av rotte lumbale DRG. Med nevrotropisk støtte fra NGF utvidet axons DRG neurons innen 3 dager etter celle seeding. Utvidet axons var tydelig observerbare etter celler var farget for CGRP protein, som er syntetisert i cellen soma og fraktet langs axon fibrene. Prosessene av satellitt cellene også utvidet, slik at disse dele gliacellene å omgi neurons innen dager. Primære DRG cellene vokst med denne protokollen er egnet for etterforskning cellulære meka...

Cellen legemer sensoriske neurons er innenfor DRG. Disse neurons er pseudo Unipolare og innervate både perifere vev og sentralnervesystemet. De eksterne nerveender sensoriske neurons finnes i muskler, hud, visceral organer og bein, blant andre vev. De overføre perifere sensasjon signaler til nerve avslutninger i spinal dorsal Hornet og signaler overføres deretter til hjernen via ulike stigende veier somatiske sensasjon1,2. Somatiske følelsen gjør kroppen til å føle (dvs., touch, smerte og termisk opplevelser) og oppfatte bevegelse og romlig orientering (proprioceptive opplevelser)1,3. Det er fire underklasser av primære afferente axons, inkludert gruppe I (Aα) fibre som svarer til Propriosepsjon av muskler, gruppe II (Aβ) fibre som svarer til mechanoreceptors av huden, og gruppere III (Aδ) og gruppe V (C) fibre som svarer til smerte og temperatur. Bare C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinated til ulike grader.
Nociceptors er primære sensoriske neurons, som er aktivert av skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kjemisk stimulering) som bærer potensialet for skade på vev. Disse neurons består av myelinated Aδ fiber og unmyelinated C fiber1,4. Aδ fiber express receptors for nerve vekst faktor (NGF, trkA reseptor), CGRP og SP. C fiber er klassifisert som enten peptidergic og ikke-peptidergic C fibre. På den annen side, uttrykke ikke-peptidergic C fibrene reseptorer for glial-avledet nevrotropisk faktor (GDNF, RET og GFR reseptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion kanal undertypen (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan karakteriseres av uttrykk for ionekanaler og aktiveres av nevrotropisk faktorer, cytokiner, neuropeptides, ATP eller andre kjemiske forbindelser8. Ved stimulering, kan nevrotransmittere, inkludert CGRP, SP og glutamat bli løslatt fra sensoriske Nevron terminaler i spinal dorsal horn å overføre nociceptive signaler2. DRG er ikke bare består av nevroner, men også inneholde satellitt gliacellene. Satellitt celler omgir sensoriske neurons og gir mekanisk og metabolske støtte9,10. Interessant er det en voksende mengde bevis som indikerer at satellitt gliacellene i DRG kan være involvert i å regulere smerte sensasjon11.
Sensoriske neurons er rapportert å være mest ofte brukte primære neuronal celler12 og har vært benyttet for elektrofysiologi, signaltransduksjon og nevrotransmitter utgivelsen studier. De er også vanlig å utforske cellulære mekanismer for neuronal utvikling, inflammatorisk smerte, nevropatisk smerte, hud sensasjon (som klør) og axon utvekst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan kultivert som dissosiert neurons å vurdere biokjemiske endringer i én eller flere celler, slik at forskere å utføre studier som ikke kan utføres i eksperimentell fag. Nylig DRG var vellykket kultivert fra menneskelige orgel givere som kan ha stor nytte translasjonsforskning16. På den annen side, kan sensoriske neurons også bli kultivert som DRG explants. De DRG explants bevare den opprinnelige vev arkitekturen av neurons, inkludert Schwann cellene og satellitt gliacellene, og er spesielt nyttig å studere samspillet mellom cellene neuronal og ikke-neuronal17. DRG primære kulturer kan lett tilberedes innen 2,5 timer. Cellen sammensetning og egenskaper er svært reflekterende av DRG slik bestemt DRG (lumbale eller thorax DRG) kan samles etter eksperimentelle krav. Kulturer av embryonale og neonatal DRG neurons kreve NGF å overleve og indusere axon utvekst, men kulturer av voksen neurons krever ikke tillegg av nevrotropisk faktorer til media12,17. Der er likeledes kommersielt anvendelig DRG-hybridoma linjer som ND7/23 og F11, som ikke krever bruk av forsøksdyr. Men mangel på forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 1 (TRPV1) uttrykk (en viktig markør for små sensoriske nociceptive neurons) og incongruent genet uttrykket profiler begrense deres programmer18. Nylig udødeliggjort DRG neuronal cellen linjer ha blitt avledet fra rotten (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet for bruk i høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. Gene expression profilering for disse linjer har imidlertid likevel skal utføres. Dermed er validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort cellene sensoriske neurons fortsatt pågående.
NPFFR2 er syntetisert i DRG og translocated til sensoriske nerve terminalene i spinal dorsal horn21. I denne artikkelen gir vi en protokoll for dyrking lumbale DRG celler og behandle dem med en Agonistiske av NPFFR2 å indusere utgivelsen av nevrotransmittere, CGRP og SP. Avhengigheten av NPFFR2 er videre testet med NPFFR2 lite forstyrrende RNA (siRNA), som kan være transfected i kulturperler DRG cellene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Dorsal root Ganglion (DRG) inneholder cellen legemer sensoriske neurons. Denne Nevron er pseudo Unipolare, med to axons som innervate perifere vev, for eksempel hud, muskler og visceral organer, samt spinal dorsal Hornet av det sentrale nervesystemet. Sensoriske neurons overføre somatiske følelsen, inkludert touch, smerte, temperatur og proprioceptive opplevelser. Derfor er DRG primære kulturer mye brukt til å studere cellulære mekanismer for nociception, fysiologiske funksjoner sensoriske neurons og neural utvikling. Kultivert neurons kan brukes i studier som involverer elektrofysiologi, signaltransduksjon, nevrotransmitter-løslate eller kalsium bildebehandling. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissosiert DRG neurons å overvåke biokjemiske endringer i én eller flere celler, overvinne mange av begrensningene knyttet i vivo eksperimenter. Sammenlignet kommersielt er tilgjengelig DRG-hybridoma linjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, komposisjon og egenskaper av primære cellene mye mer lik sensoriske neurons i vev. På grunn av begrenset antall kulturperler DRG primære celler som kan isoleres fra en enkelt dyr, er det imidlertid vanskelig å utføre høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. I gjeldende artikkel er prosedyrer for DRG samling og kultur beskrevet. I tillegg viser vi behandling av kultivert DRG celler med en Agonistiske neuropeptide FF reseptor type 2 (NPFFR2) å indusere utgivelsen av peptid nevrotransmittere (calcitonin gen-relaterte peptid (CRGP) og substans P (SP)).

Rotte lumbale DRG neurons, kultivert i en 24-vel plate, ble dyrket i kultur medium med ekstra Ara-C å hemme glial celle spredning og NGF å støtte dannes hemmer nevronal vekst. Morfologi av levende DRG celler ble observert. Som vist i Figur 3, var celle kroppen av en enkelt Nevron festet på bunnen av en rett på dag 1 og valgt for observasjon. Axon vekst var overvåket fra dag 1-3. Gliacellene dupliseres og utvidet prosesser å omgi celle kroppen av sensor...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root Ganglion (DRG) primære kulturer brukes ofte til å studere fysiologiske funksjoner eller patologi-relaterte hendelser i sensoriske neurons. Her viser vi bruk av lumbale DRG kulturer å oppdage utgivelsen av nevrotransmittere etter neuropeptide FF reseptor type 2 stimulering med en selektiv Agonistiske.

Dorsal Root Ganglion isolasjon og primære kultur for å studere nevrotransmitter-løslate

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i sensorisk forskningsfelt, for eksempel perifer nociception. Den største fordelen med denne tekniske er at å undersøke cellulær mekanisme av sensoriske nevroner med modellen som de fleste simulerer til fysiologisk tilstand. Samle lumbal dorsal rot ganglia fra stammen av en to til tre uker gammel rotte.Begynn med å gjøre to kutt langs sidene av ryggsøylen og en lateral kutt for å markere rostral omfanget av lumbale ryggraden. Deretter bruker du beinskjærende tang for å fjerne ryggmuskulaturen i ryggraden. Deretter fjerner du ryggvirvlenes ryggvirvler og eksponerer ryggmargen.Bruk deretter disseksjonsaks og tang for å fjerne ryggmargen. Identifiser lumbal DRG ved å telle ryggvirvler fra siste ribbe. Dette diagrammet viser ryggvirvlene posisjoner.Bruk mikrosaks til å samle de 12 bilaterale lumbale DRG fra L1 til L6. Fjern eventuelle vedlagte nevronale fibre for å forbedre kulturens renhet. Overfør hver lumbal DRG til en 35 millimeter kulturrett som inneholder to milliliter iskaldt serumfritt medium. Overfør DRG-inneholdende 35 millimeter parabolen til en laminær hette, og vask DRG med serumfritt medium tre ganger med pipette.Bruk sterile pinsett til å flytte DRGs til en ny 35 millimeter kulturrett som inneholder to milliliter steril collagenase type 1A. Plasser vevet i kollagenoppløsning i 37 grader Celsius vevkulturinkubator i 30 minutter for å begynne dissosiasjon av cellene. Etter inkubasjonen fjerner du kollagenaseoppløsningen og vaskER DRG tre ganger i to milliliter av Hanks balanserte saltoppløsning.Deretter legger du til to milliliter med forvarmede 0,05% trypsin EDTA til parabolen, og fordøye DRG i inkubatoren i 30 minutter som før. Etter fordøyelsen, bruk en glasspipette til å overføre de to milliliter av DRG-inneholdende løsning til en 15 milliliter sentrifuge rør. DRG kan holde seg til glasspipetten, så dette trinnet bør utføres med forsiktighet.Det faktiske tapet kan unngås ved å holde DRG-holdende oppløsning i den nedtrappede enden av glasspipetten, og overføre løsningen til sentrifugerøret sakte, men uten pause. Deretter sentrifugerer løsningen ved 290 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering fjerner du supernatanten og legger til ytterligere to milliliter serumfritt medium for å bruke DRG på nytt.Gjenta vasken to ganger, ved hjelp av to milliliter med forvarmet kulturmedium for å gjenopplive vevet etter den endelige sentrifugasjonen. Bruk den tidligere klargjorte sterile flammepolerte pipetten til å triturere DRG manuelt ca. 60 ganger. Deretter fjerner du en poly-L-lysinbelagt 24 brønnplate som inneholder en milliliter kulturmedium per brønn fra CO2-inkubatoren.Aspirer det inkuberte kulturmediet fra parabolen. Seed DRG-cellene fra en rotte til fire av brønnene. Dette gir en såetetthet på ca 500 000 celler per brønn.Neste dag, erstatte kultur medium med medium supplert med 10 mikromolar AraC, og 100 nanograms per milliliter NGF. På dag tre etter celleplating endrer du mediet til 0,5 milliliter med førkrigsset serumfritt medium, og inkubere i en time. Under inkubasjonen, tilsett 50 millimolar siRNA i ett mikroliter RNase-fritt vann til 12,5 mikroliter serumfritt medium per transinfeksjon.Pipette 2,5 mikroliter transinfeksjonsreagens i 10 mikroliter serumfritt medium for hver transfeksjon. Bland begge løsningene med pipette, og inkuber denne blandede transfeksjonsløsningen i 10 minutter ved romtemperatur. Etter 10 minutter, tilsett transfeksjonsløsningen i brønnene til DRG-inneholder 24 brønnplaten og bland ved å riste forsiktig.Etter en seks timers inkubasjon, legge til 0,5 milliliter kultur medium med 20% FBS, 10 mikromolar AraC, og 100 nanograms per milliliter NGF i hver brønn av celler. Til slutt inkuber DRG i en 37 grader Celsius CO2 inkubator i ytterligere 66 timer. På dag seks etter plating, og 72 timer etter siRNA transfection, endre kulturmediet til 200 mikroliter serumfritt medium.Etter en 30 minutters inkubasjon, legg til en mikroliter av stimuleringskjemisk og bland forsiktig ved pipettering. NPFFR2-agonisten, dNPA og tilsvarende kjøretøy brukes her. Etter inkubering for den nødvendige perioden, samle kulturmediet fra kulturfatet, og sentrifuge på 5000 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius for å fjerne eventuelle suspenderte urenheter.Samle supernatanten fra sentrifugeringen og fortynne med fosfatbufret saltvann etter behov. Analyse nivåene av nevrotransmittere med kommersielt tilgjengelige enzym immunanalyse kits. På dag én var cellekroppen til et enkelt nevron indikert av pilen festet på bunnen av en tallerken.En glialcelle indikert av et pilhode er også til stede. Glialcellene dupliserte og utvidede prosesser for å omgi cellekroppen til sensorisk nevron på dag to, en prosess som var enda mer fremtredende på dag tre. I en annen kultur ble CGRP-protein farget for å avsløre formen på nevroner.CGRP proteinfarging vises i cytoplasma og aksoner av sensoriske nevroner. De kjernefysiske morfologiene til nevroner og glialceller er forskjellige når de er farget med DAPI. Nevronene har en større og mer avrundet kjerne enn glialceller.Til sammenligning er kjernene av glial mer ovale i form. Når mestret, kan denne teknikken gjøres i to og en halv time hvis den utføres riktig. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du dissekerer og kultur den dorsale rotganglionen, og bruk den som et verktøy for å undersøke underliggende fysiologiske funksjoner.Ikke glem at det å jobbe med primærceller kan være mye vanskeligere enn å arbeide med vanlige cellelinjer, og å være forsiktig er alltid den beste måten når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging av nikotin Induced Kalsium alarm og neurotransmitterfrigivning Sammen ventral Hippokampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilnærming for å forbedre Justering og myelination av Dorsal Root ganglion nevroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulisk Ekstrudering av ryggmargen og isolering av de dorsale nerveknutene i Gnagere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalrotganglion Injeksjon og rygg Root knusningsskade som en modell for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rask isolering av rygg rot Ganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Anrikning av voksne mus Dorsal Root Ganglia Neuron Kulturer ved Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...