Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
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Agradecemos o Dr. M. Calkins para edição inglesa. Este trabalho foi apoiado pelo Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, centro de pesquisa de envelhecimento saudável (EMRPD1G0171) e Ministério da ciência e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).

Todos os métodos descritos neste documento que usam animais experimentais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e usar Comité (IACUC) de Chang Gung University (CGU 13-014).
1. colete lombar DRG de ratos experimentais
<ol><li>Use 2 a 3 ratos Sprague-Dawley (SD) de semanas para coleção de DRG lombar. Nota: Os neurônios DRG coletados de ratos durante 4 semanas de idade não crescem bem sob as condições de cultura aqui descritas.</li>
	<li>Esterilize todos os instrumento...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. 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No presente artigo, demonstramos a coleção, enzima-dissociação e cultura de lombar rato DRG. Com o apoio de neurotrophic de NGF, os axônios dos neurônios DRG estendido dentro de 3 dias após a semeadura da célula. Os axônios estendidos foram claramente observáveis após células foram coradas para proteína CGRP, o qual é sintetizada no soma de célula e transportada ao longo das fibras de axônio. Os processos de células satélites também estendidos, permitindo que estas células gliais divisórias cercar os...

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais estão contidos DRG. Estes neurônios são pseudo unipolares e inervam tanto tecidos periféricos e sistema nervoso central. As terminações de nervos periféricos de neurônios sensoriais encontram-se em músculo, pele, órgãos viscerais e osso, entre outros tecidos. Eles transmitem sinais periféricos sensação nervo terminações no Corno dorsal da coluna vertebral e os sinais são então transmitidas para o cérebro através de diferentes percursos ascendentes da sensação somática1,2. Sensação somática permite o corpo a sentir (ou seja, toque, dor e sensações térmicas) e perceber o movimento e orientação espacial (sensações proprioceptivas)1,3. Existem quatro subclasses de axônios aferentes primários, incluindo grupo I fibras (Aα) que respondem a propriocepção dos músculos esqueléticos, fibras de grupo II (Aβ) que respondem a mecanorreceptores da pele, e grupo III (Aδ) e fibras de V (C) do grupo que respondem à dor e temperatura. Somente as fibras C são amielínicas, enquanto o resto são mielinizadas de diferentes graus.
Os nociceptores são neurônios sensoriais primários, que são ativados por estímulos nocivos (estimulação mecânica, térmica e química) que carregam o potencial de dano tecidual. Estes neurônios são compostos de fibras mielinizadas de Aδ e amielínicas C fibras1,4. As fibras Aδ expressam os receptores para fator de crescimento do nervo (NGF, trkA receptor), CGRP e SP. As fibras C são classificadas como peptidérgicos ou não-peptidérgicos fibras C. Por outro lado, fibras C não-peptidérgicos expressam os receptores para fator neurotrófico derivado de glia (GDNF, RET e GFR receptores), isolectin IB4 e iônicos ATP canal subtipo (P2X3)5,6,7. Os nociceptores podem ser distinguidos pela expressão de canais iônicos e ativados por fatores neurotróficos, citocinas, neuropeptídeos, ATP ou outros químicos, compostos de8. Estimulação, neurotransmissores, incluindo CGRP, SP e glutamato podem ser liberados da terminais do neurônio sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral para transmitir sinais nociceptivos2. DRG não são apenas composto de neurônios, mas também contêm células gliais do satélite. Células satélites envolvem os neurônios sensoriais e fornecer apoio mecânico e metabólica9,10. Curiosamente, há um crescente corpo de evidências que indicam que células gliais satélite em DRG podem estar envolvidas na regulação da dor sensação11.
Neurônios sensoriais foram relatados para ser o mais frequentemente usado células neuronais primários12 e têm sido utilizado para estudos de liberação do neurotransmissor, transdução de sinal e Eletrofisiologia. Eles também são comumente usados para explorar os mecanismos celulares de desenvolvimento neuronal dor inflamatória, dor neuropática, sensação de pele (como coceira) e axônio consequência12,13,14,15. Culturas primárias de DRG podem ser cultivadas como neurônios dissociados para avaliar as alterações bioquímicas em uma ou várias células, permitindo que os cientistas realizar estudos que não podem ser executados em disciplinas experimentais. Recentemente, o DRG foram cultivadas com sucesso de doadores de órgãos humanos que podem beneficiar muito a pesquisa translacional16. Por outro lado, os neurônios sensoriais também podem ser cultivados como DRG explants. Os explantes DRG preservar a arquitetura original do tecido dos neurônios, incluindo células de Schwann e células gliais do satélite e são especialmente úteis para estudar as interações entre as células neuronais e não-neuronal17. Culturas primárias de DRG podem ser facilmente preparadas dentro de 2,5 h. A composição celular e propriedades são altamente reflexivas da fonte DRG, e como tal, DRG específico (DRG lombar ou torácica) pode ser recolhido de acordo com demandas experimentais. Culturas de neurônios DRG embrionários e Neonatais requerem NGF sobreviver e induzir a consequência natural do axônio, mas culturas de neurônios adultos não necessitam da adição de fatores neurotróficos para a mídia12,17. Existem também linhas de células de hibridoma-DRG comercialmente disponíveis como ND7/23 e F11, que não exigem o uso de animais experimentais. No entanto, a falta de cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) expressão (um importante marcador para pequenos neurônios nociceptivos sensoriais) e perfis de expressão de gene incongruentes limitam seus aplicativos18. Recentemente, imortalizada célula neuronal DRG linhas foram derivadas de rato (50B11)19 e rato (MED17.11)20, que são apropriados para usam em telas de alta produtividade para drogas como alvo de estudos. No entanto, a expressão gênica profiling para estas linhas de célula ainda tem de ser realizada. Assim, os experimentos de validação comparando estas células imortalizadas de neurônios sensoriais ainda estão em andamento.
NPFFR2 é sintetizado em DRG e translocados para os terminais de nervo sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral21. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para cultivo de células DRG lombares e tratá-los com um agonista de NPFFR2 para induzir a liberação de neurotransmissores, CGRP e a SP. A dependência de NPFFR2 mais é testada usando NPFFR2 pequena interferência do RNA (siRNA), que pode transfected em culturas de células de DRG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm os corpos celulares dos neurônios sensoriais. Este tipo de neurônio é pseudo unipolar, com dois axônios que inervam tecidos periféricos, tais como pele, músculos e órgãos viscerais, bem como o corno dorsal da coluna vertebral do sistema nervoso central. Neurônios sensoriais transmitem sensação somática, incluindo dor, toque, sensações térmicas e proprioceptivas. Portanto, culturas primárias de DRG são amplamente utilizadas para estudar os mecanismos celulares de nocicepção, funções fisiológicas de neurônios sensoriais e desenvolvimento neural. Os neurônios cultivados podem ser aplicados em estudos envolvendo a eletrofisiologia, transdução de sinal, liberação de neurotransmissores ou imagem de cálcio. Com culturas primárias de DRG, os cientistas podem cultura dissociada DRG neurônios para monitorar as alterações bioquímicas no single ou várias células, superando muitas das limitações associadas com experiências na vivo . Em comparação com comercialmente disponíveis linhas de células de hibridoma-DRG ou imortalizado DRG célula neuronal linhas, da composição e propriedades das células primárias são muito mais semelhantes a neurônios sensoriais no tecido. No entanto, devido ao número limitado de culturas de células primárias DRG que pode ser isolado de um único animal, é difícil de executar telas de alto rendimento para drogas como alvo de estudos. No artigo atual, são descritos os procedimentos para a recolha de DRG e cultura. Além disso, vamos demonstrar o tratamento de pilhas cultivadas DRG com um agonista do neuropeptídio FF do receptor tipo 2 (NPFFR2) para induzir a liberação de neurotransmissores de peptídeo ((CRGP) peptídeo relacionados ao gene da calcitonina e substância P (SP)).

Neurônios DRG lombares rato, cultivados em uma placa de 24, foram cultivados em meio de cultura com Ara-C adicional para inibir a proliferação das células gliais e NGF para apoiar o crescimento neuronal. A morfologia de vida observou-se células DRG. Como mostrado na Figura 3, o corpo celular de um único neurônio foi anexado no fundo de um prato no dia 1 e selecionado para observação. Crescimento do axônio foi monitorado desde dia 1 – 3. As célula...

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Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa sensorial, como nocicepção periférica. A principal vantagem desse técnico é que investigar o mecanismo celular dos neurônios sensoriais com o modelo que mais simula a condição fisiológica. Pegue o gânglio dorsal lombar do tronco de um rato de duas a três semanas.Comece fazendo dois cortes ao longo dos lados da coluna vertebral e um corte lateral para marcar a extensão rostral da coluna lombar. Em seguida, use fórceps de corte ósseo para remover os músculos dorsais da coluna. Em seguida, remova a porção dorsal das vértebras e exponha a medula espinhal.Em seguida, use uma tesoura de dissecção e fórceps para remover a medula espinhal. Identifique o DRG lombar contando vértebras da última costela. Este diagrama mostra as posições das vértebras.Use micro tesoura para coletar o DRG lombar bilateral de L1 a L6. Remova quaisquer fibras neuronais ligadas para melhorar a pureza da cultura. Transfira cada DRG lombar para um prato de cultura de 35 milímetros contendo dois mililitros de meio sem soro frio. Transfira o prato de 35 milímetros contendo DRG em um capô laminar e lave o DRG com meio livre de soro três vezes por pipeta.Use pinças estéreis para mover os DRGs para um novo prato de cultura de 35 milímetros contendo dois mililitros de colagem estéril tipo 1A. Coloque o tecido na solução de colagemnase na incubadora de cultura tecidual Celsius de 37 graus por 30 minutos para iniciar a dissociação das células. Após a incubação, remova a solução de colagem e lave o DRG três vezes em dois mililitros da solução de sal balanceada da Hank.Em seguida, adicione dois mililitros de edta de 0,05% de tripca pré-equipado ao prato, e digerir o DRG na incubadora por 30 minutos como antes. Após a digestão, use uma pipeta de vidro para transferir os dois mililitros da solução contendo DRG para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. O DRG pode grudar na pipeta de vidro, de modo que este passo deve ser realizado com cuidado.A perda real pode ser evitada mantendo a solução contendo DRG na extremidade mais afunilada da pipeta de vidro, e transferindo a solução para o tubo centrífuga lentamente, mas sem pausa. Em seguida, centrifugar a solução a 290 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o supernasce e adicione mais dois mililitros de meio livre de soro para resuspensar o DRG.Repita a lavagem duas vezes, usando dois mililitros de meio de cultura pré-armado para resuspensar o tecido após a centrifugação final. Use a pipeta polida de chama estéril previamente preparada para triturar manualmente o DRG aproximadamente 60 vezes. Em seguida, remova uma placa revestida de poli-L-lysine de 24 poços contendo um mililitro de cultura por poço da incubadora de CO2.Aspire o meio de cultura incubada do prato. Semeou as células DRG de um rato em quatro dos poços. Isso dá uma densidade de semeadura de aproximadamente 500.000 células por poço.No dia seguinte, substitua o meio de cultura por meio suplementado por 10 micromolar AraC, e 100 nanogramas por mililitro NGF. No terceiro dia após o revestimento da célula, mude o médio para 0,5 mililitros de meio sem soro pré-armado e incubar por uma hora. Durante a incubação, adicione 50 mililitros de siRNA em um microlitr de água livre de RNase a 12,5 microliters de meio livre de soro por transfecção.Em seguida, pipeta 2,5 microliters de reagente transfecção em 10 microliters de meio livre de soro para cada transfecção. Misture ambas as soluções por pipeta e incuba esta solução de transfecção mista por 10 minutos à temperatura ambiente. Após 10 minutos, adicione a solução de transfecção nos poços da placa de 24 poços contendo DRG e misture tremendo suavemente.Após uma incubação de seis horas, adicione 0,5 mililitros de meio de cultura com 20% FBS, 10 AraC micromolares e 100 nanogramas por mililitro NGF em cada poço de células. Por fim, incubar o DRG em uma incubadora de CO2 de 37 graus Celsius por mais 66 horas. No sexto dia após o revestimento, e 72 horas após a transfecção do siRNA, mude o meio de cultura para 200 microliters de meio livre de soro.Após uma incubação de 30 minutos, adicione um microliter do produto químico de estimulação e misture suavemente por pipetação. O agonista NPFFR2, dNPA e o veículo correspondente são usados aqui. Depois de incubar pelo período necessário, colete o meio de cultura do prato de cultura, e centrífuga a 5000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover quaisquer impurezas suspensas.Recolher o supernacido da centrifugação e diluir com soro fisiológico tamponado com fosfato, conforme necessário. Teste os níveis de neurotransmissores com kits de imunoensaio de enzimas disponíveis comercialmente. No primeiro dia, o corpo celular de um único neurônio indicado pela seta foi anexado na parte inferior de um prato.Uma célula gliais indicada por uma ponta de flecha também está presente. As células gliais duplicaram e estenderam processos para cercar o corpo celular do neurônio sensorial no segundo dia, processo que foi ainda mais proeminente no terceiro dia. Em outra cultura, a proteína CGRP foi manchada para revelar a forma dos neurônios.A coloração da proteína CGRP aparece no citoplasma e axônios dos neurônios sensoriais. As morfologias nucleares de neurônios e células gliais são distintas quando manchadas com DAPI. Os neurônios têm um núcleo maior e mais arredondado do que as células gliais.Em comparação, os núcleos do glial são mais ovais em forma. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas e meia se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar e cultivar o gânglio raiz dorsal, e usá-lo como uma ferramenta para investigar funções fisiológicas subjacentes.Não se esqueça que trabalhar com células primárias pode ser muito mais difícil do que trabalhar com linhas celulares regulares, e ser gentil é sempre a melhor maneira de realizar esses procedimentos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Neurociência

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...