Name: dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Мы благодарим д-р м. Калкинс для английского редактирования. Эта работа была поддержана Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPD1F0482), Чжан Гун университета, здоровые старения научно-исследовательский центр (EMRPD1G0171) и Министерство науки и технологии (105-2320-B-182-012-MY2).

Все методы, описанные здесь, которые используют подопытных животных были утверждены институциональный уход животных и использовать Комитет (IACUC) Чжан Гун университета (Ге 13-014).
1. сбор поясничного DRG от экспериментальных крыс
<ol><li>Использовать 2-3 недели старый крысах Sprague-...

<ol>
	<li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroscience: exploring the brain. , (2007).</li><li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+dynamics+of+pain+control.">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li><li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of neural science. , (2000).</li><li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+nociception.">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li><li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain.">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li><li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperalgesia+and+allodynia:+peripheral+mechanisms.">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li><li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li><li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain.">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat.">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li><li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain:+an+in+vivo+and+in+vitro+study.">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).</li><li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain.">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li><li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch.">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li><li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures.">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li><li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures:+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies.">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li><li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons:+A+transcriptomic+comparison.">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li><li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line.">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li><li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors.">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).</li><li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn.">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li><li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice.">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li><li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia.">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li><li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain.">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li></ol>

В настоящей статье, мы демонстрируем коллекции, фермент диссоциации и культуры крыса поясничный DRG. При поддержке нейротрофических ФРН аксоны нейронов DRG расширена в течение 3 дней после посева клеток. Расширенный аксоны были явно наблюдаемой после того, как клетки окрашивали CGRP белок, ?...

Клетки тела сенсорных нейронов, содержатся внутри DRG. Эти нейроны псевдо-однополярного и иннервируют периферических тканей и центральной нервной системы. Периферических нервных окончаний Сенсорные нейроны находятся в мышц, кожи, внутренних органов и костей, среди других тканей. Они передают сигналы периферийного ощущения нерв, который затем окончаний в спинного мозга Спинной рога и сигналы передаются в мозг через различные восходящем пути соматические ощущения1,2. Соматические ощущения позволяет организму чувствовать себя (то есть, сенсорный, боль и тепловых ощущений) и воспринимать движение и пространственной ориентации (проприоцептивной ощущений)1,3. Есть четыре подклассы первичных афферентных аксонов, в том числе, группа I (aα диалога доступных) волокон, которые реагируют на Проприоцепцию скелетных мышц, группа II (значения) волокон, которые реагировать механорецепторов кожи, и группы III (Aδ) и V (C) волокон в группы, которые реагируют на боль и Температура. Только С-волокна являются unmyelinated, в то время как остальные Миелинизированные в разной степени.
Ноцицепторами являются первичных сенсорных нейронов, которые активируются вредных раздражителей (механические, тепловые и химические стимуляции), которые несут потенциал для повреждения тканей. Эти нейроны состоят из Миелинизированные Aδ волокна и волокна1,unmyelinated C4. Aδ волокна Экспресс рецепторов фактора роста нервов (ФРН, Ведьмина рецепторов), CGRP и SP. С-волокна, классифицируются как peptidergic и не peptidergic С-волокна. С другой стороны не peptidergic С-волокна Экспресс рецепторов для глиальной нейротрофического фактора (рецепторов GDNF, RET и Федеративная Республика Германия), isolectin IB4 и АТФ закрытый ионного канала подтип (P2X3)5,6,7. Ноцицепторами можно отличить выражением ионных каналов и активированную нейротрофических факторов, цитокины, Нейропептиды, АТФ или других химических соединений8. После стимуляции нейротрансмиттеров, включая CGRP, SP и глутамат может быть освобожден от сенсорных нейронах терминалов в спинного мозга Спинной рога для передачи сигналов ноцицептивных2. DRG состоят не только из нейронов, но также содержат Спутниковое глиальных клеток. Спутниковое клетки окружают сенсорных нейронов и обеспечивают механические и метаболизм поддержки9,10. Интересно, что существует растущий объем свидетельств, указывающих, что Спутниковое глиальные клетки в DRG могут быть вовлечены в регулировании боли ощущение11.
Чтобы быть наиболее часто используемые первичной нейрональные клетки12 и были использованы для электрофизиологии, сигнала и нейромедиатора релиз исследований сообщалось сенсорных нейронов. Они также часто используются для изучения клеточных механизмов развития нервной системы, воспалительные боли, невропатической боли, ощущение кожи (как зуд) и аксон нарост12,13,14,15. DRG первичных культур может культивировали как диссоциированных нейронов оценивать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, позволяет ученым для проведения исследований, которые не может быть выполнена экспериментальная предметам. Недавно DRG были успешно культивировали человеческий орган доноров, которые могли бы пользу трансляционного исследования16. С другой стороны Сенсорные нейроны могут также выращиваются как DRG эксплантах. DRG эксплантов сохранить оригинальную архитектуру ткани нейронов, включая Шванновские клетки и спутниковое глиальных клеток и особенно полезны для изучения взаимодействия нейронов и не нейрональные клетки17. DRG первичных культур можно легко приготовить в течение 2,5 ч. Клеточный состав и свойства высокой отражающей способностью источника DRG, и таким образом, конкретные DRG (поясничный или грудной DRG) может быть собрана по данным экспериментальных требования. Культурах эмбриональных и неонатальной DRG нейронов требуют NGF выжить и вызвать нарост аксона, но культуры взрослых нейроны не требуют добавления нейротрофических факторов к СМИ12,17. Существует также коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий, таких как ND7/23 и F11, которые не требуют использования экспериментальных животных. Однако, отсутствие Переходный рецепторный потенциал катионного канала член subfamily V 1 (TRPV1) выражение (важный маркер для малых сенсорных нейронов ноцицептивных) и несовместимые ген выражение профили ограничивают их приложения18. Недавно увековечен DRG нейрональных клеток линии были получены от крыс (50B11)19 и20мыши (MED17.11), которые подходят для использование в экраны высокой пропускной способностью для ориентации исследования наркотиков. Однако выражение гена профилируя для этих клеточных линий еще предстоит выполнить. Таким образом еще продолжаются эксперименты проверки, сравнивая эти увековечен клетки для сенсорных нейронов.
NPFFR2 синтезируется в DRG и арестовано сенсорные нервные окончания в Рог спинного мозга Спинной21. В этой статье мы предоставляем протокол для культивирования поясничного DRG клетки и относиться к ним с агониста NPFFR2 побудить освобождения нейромедиаторов, CGRP и SP. Зависимость от NPFFR2 Далее проверяется с использованием NPFFR2 малые интерферирующие РНК (siRNA), который может transfected в клетки культивировали DRG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-033-1</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12400024</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9011</td>
			<td>Coating dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9001-12-1</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-051-5</td>
			<td>Enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td>Cell trituration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NC011</td>
			<td>Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPFFR2 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-099691-02-0005</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-001810-10-05</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroPORTER Reagent</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T400150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNPA</td>
			<td>Genemed Synthesis</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NPFFR2 agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>589001</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP ELISA</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>583751</td>
			<td>EIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGRP antibody</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>PC205L</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>IHC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release

Спинной корень ганглиев (DRG) содержат ячейки органов сенсорных нейронов. Этот тип нейрон псевдо-однополярного, с двумя аксонов, которые иннервируют периферических тканях, такие, как кожи, мышц и внутренних органов, а также спинного мозга Спинной рога центральной нервной системы. Сенсорные нейроны передают соматические ощущения, включая сенсорный, боль, тепловой и проприоцептивная ощущений. Таким образом DRG первичных культур широко используются для изучения клеточных механизмов Ноцицепция, физиологических функций сенсорных нейронов и нейронных развития. Культивированный нейроны могут быть применены в исследованиях с участием электрофизиологии, сигнальной трансдукции, нейромедиатора релиз или кальция изображений. С DRG основных культур ученые могут культура диссоциированных нейронов DRG контролировать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, преодолевая многие из ограничений, связанных с экспериментов в естественных условиях . По сравнению с коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий или увековечен DRG нейрональных клеточных линий, состав и свойства клеток первичного гораздо больше похожи на сенсорных нейронов в ткани. Однако из-за ограниченное количество культивируемых DRG первичных элементов, которые могут быть изолированы от одного животного, трудно выполнить высок объём экраны для ориентации исследования наркотиков. В текущей статье описаны процедуры сбора DRG и культуры. Кроме того мы демонстрируем лечение клетки культивировали DRG с агонистом рецепторов типа нейропептида FF 2 (NPFFR2), с тем чтобы побудить освобождения нейромедиаторов пептида (пептид связанных с геном кальцитонина (CRGP) и вещество P (SP)).

Крыса поясничного DRG нейронов, культивируемых в пластине 24-а, были выращены в питательной среды с дополнительные Ara-C, чтобы препятствовать пролиферация глиальных клеток и ФРН в поддержку нейрональных роста. Морфология жизни DRG клеток наблюдалось. Как показано на <strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release at JoVE.com

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Спинной корень ганглиев (DRG) первичных культур часто используются для изучения физиологических функций или события, связанные с патологией в сенсорных нейронов. Здесь мы продемонстрировать использование поясничной DRG культур для обнаружения освобождения нейромедиаторов, после нейропептида FF рецептор типа 2 стимуляции с селективным агонистом.

Спинной корень ганглиев изоляции и основной культуры для изучения нейромедиатора релиз

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сенсорных исследований, таких как периферическое ноцицепция. Основным преимуществом этого технического является то, что исследование клеточного механизма сенсорных нейронов с моделью, которая наиболее имитирует физиологическое состояние. Соберите поясничный спинной корень ганглиев из ствола двух-трехнедельной крысы.Начните с двух разрезов по бокам позвоночника и один боковой разрез, чтобы отметить ростральный размер поясничного отдела позвоночника. Затем используйте костно-резаные миппы для удаления спинных мышц позвоночника. Затем удалите спинную часть позвонков и обнажите спинной мозг.Затем используйте ножницы и типсы для удаления спинного мозга. Определите поясничный DRG, подсчитав позвонки из последнего ребра. На этой диаграмме показаны положения позвонков.Используйте микро ножницы для сбора 12 двусторонних поясничных DRG от L1 до L6. Удалите любые прикрепленные нейронные волокна, чтобы улучшить чистоту культуры. Перенесите каждый поясничный DRG на 35-миллиметровое культурное блюдо, содержащее два миллилитра среды, свободной от холодной сыворотки. Перенесите ДРГ-содержащую 35-миллиметровую тарелку в ламинарный капюшон и трижды промойте DRG с помощью безотовилочной среды пипеткой.Используйте стерильные пинцеты, чтобы переместить DRGs в новое 35-миллиметровое блюдо культуры, содержащее два миллилитров стерильной коллагеназы типа 1A. Поместите ткань в раствор коллагеназы в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы начать диссоциацию клеток. После инкубации удалите раствор коллагеназы и помойте DRG три раза в два миллилитров сбалансированного соленого раствора Хэнка.Затем добавьте в блюдо два миллилитров предварительно приготовленного 0,05%трипсина ЭДТА и усваиваете DRG в инкубаторе в течение 30 минут, как и раньше. После пищеварения используйте стеклянную пипетку для переноса двух миллилитров раствора, содержащего DRG, в 15-миллилитровую центрифугу. DRG может придерживаться стеклянной пипетки, так что этот шаг должен быть выполнен с осторожностью.Фактической потери можно избежать, сохраняя DRG-содержащий раствор в конусном конце стеклянной пипетки, и передачи раствора в центрифугу трубку медленно, но без паузы. Далее центрифуга раствора при 290 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования, удалить супернатант и добавить еще два миллилитров сыворотки свободной среды для повторного перерасхода DRG.Повторите мыть дважды, используя два миллилитров довоенной среды культуры, чтобы повторно использовать ткань после окончательной центрифугации. Используйте ранее подготовленные стерильные пламя полированной пипетки вручную тритурировать DRG примерно 60 раз. Затем удалите из инкубатора CO2 поли-L-лизин покрытием 24 хорошо пластины, содержащие один миллилитр культуры среды на колодец.Аспирировать инкубированную культурную среду из блюда. Семя DRG клеток от одной крысы в четыре скважины. Это дает плотность посева около 500 000 клеток на колодец.На следующий день замените культурную среду средой, дополненной 10 микромолярной AraC и 100 нанограммами на миллилитр NGF. На третий день после покрытия клеток, изменить средний до 0,5 миллилитров довоенной сыворотки свободной среды, и инкубировать в течение одного часа. Во время инкубации добавьте 50 миллимолярной siRNA в один микролитр воды без RNase до 12,5 микролитров без сыворотки среды на трансфекцию.Затем пипетка 2,5 микролитров трансфектного реагента в 10 микролитров безотовичной среды для каждой трансфекции. Смешайте оба раствора пипеткой и инкубировать этот смешанный раствор трансфекции в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут добавьте раствор трансфекции в колодцы пластины, содержащей 24 скважины DRG, и аккуратно перемешайте.После шестичасовой инкубации добавьте 0,5 миллилитров среды культуры с 20%FBS, 10 микромолярной AraC и 100 нанограмм на миллилитр NGF в каждый колодец клеток. Наконец, инкубировать DRG в 37 градусов по Цельсию CO2 инкубатор в течение еще 66 часов. На шестой день после покрытия и через 72 часа после трансфекции siRNA измените культурную среду до 200 микролитров среды, свободной от сыворотки.После 30-минутной инкубации добавьте один микролитер химического вещества стимуляции и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Здесь используются агонист NPFFR2, dNPA и соответствующий автомобиль. После инкубации в течение необходимого периода, собирать культуру среды из культуры блюдо, и центрифуга в 5000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы удалить любые приостановленные примеси.Соберите супернатант из центрифугации и разбавлять фосфатным буфером солевым раствором по мере необходимости. Анализ уровней нейротрансмиттеров с коммерчески доступными наборами ферментного иммуноанализа. В первый день на дно блюда было прикреплено клеточное тело одного нейрона, указанное стрелкой.Глиальная ячейка, указанная наконечником стрелы, также присутствует. Глиальные клетки дублировали и расширили процессы, чтобы окружить клеточное тело сенсорного нейрона на второй день, процесс, который был еще более заметным на третий день. В другой культуре белок CGRP был окрашен, чтобы выявить форму нейронов.CGRP окрашивание белка появляется в цитоплазме и аксоны сенсорных нейронов. Ядерные морфологии нейронов и глиальных клеток отличаются, когда окрашены DAPI. Нейроны имеют большее и более округлое ядро, чем глиальные клетки.Для сравнения, ядра глиальных более овальные по форме. После освоения, этот метод может быть сделано в течение двух с половиной часов, если она выполняется должным образом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как вскрыть и культуры спинного корня ганглиона, и использовать его в качестве инструмента для расследования основных физиологических функций.Не забывайте, что работа с первичными клетками может быть гораздо сложнее, чем работа с обычными клеточными линиями, и быть нежным всегда лучший способ при выполнении этих процедур.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Хроматин Иммунопреципитация из ткани спинного Ganglia Корневая следующие аксональное повреждение

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Живая съемка Спинной Аксоны Корневая после ризотомия

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Спинных нейронов и дифференцированных жировой стволовых клеток, полученных:<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-культура моделью для изучения периферических нервов Регенерация

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Спинальный ганглий Injection и дорсальных корешков размозжение как модель для регенерации Сенсорное Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Быстрая изоляция дорсал Корень Ganglion Макрофаги

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Обогащение культур нейронов ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей методом иммунопаннирования

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...