Name: thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
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Martin Danner est reconnu pour son aide dans la préparation des échantillons et la mise en place des procédures de culture cellulaire. Les auteurs tiennent à remercier Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hambourg, Allemagne), en particulier Robert Radsziwill pour un soutien continu et des discussions. La recherche ayant abouti à ces résultats a été financé par le Conseil européen de la recherche au titre septième Programme-cadre (FP/2007-2013) Convention de subvention ERC n. de l’Union européenne 340929.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception de structures composites permet l’ajustement simple des propriétés des matériaux, tels que le module de Young ou l’épaisseur des échantillons. Le module de Young du PDMS est effectivement modifiable dans un large éventail en modifiant le rapport de mélange entre les deux composantes ou fabrication de mélanges en utilisant un autre silicone élastomère30,31. Les méthodes décrites ne sont pas limités à de la PDMS utilisé dans l’enquête en cours, mais surtout la performance adhésive dépend fortement du type spécifique utilisé. Une étape cruciale dans le présent protocole est le procédé de fabrication des films composites (Figure 1). Il a été démontré que l’épaisseur des films affecte sensiblement le comportement de l’adhérence des films sur différents substrats, y compris la peau (Figure 5 et Figure 6). Outre l’épaisseur du film, temps et température pendant le processus de durcissement affecte les propriétés matérielles32. Paramètres que l’épaisseur des couches polymères doivent être adaptées et vérifié avec soin.
Analyse des propriétés adhésives des films minces a été réalisée avec les mesures d’adhérence de force normale à l’aide de deux substrats de verre avec une rugosité différente jusqu'à Ra = 0,338 µm (Figure 3). En général, rugosité effets sensiblement l’adhérence des surfaces, en particulier des matériaux élastiques33,,34. La rugosité du verre peut être facilement modifiée par ponçage au papier de verre de tailles différentes aspérités, ce qui permet la fabrication de substrats présentant plus de valeurs de rugosité21. En outre, les autres matériaux, par exemple la résine époxyde utilisable pour la production de substrats15,35. Cela pourrait être une stratégie importante modification du protocole présenté. Par exemple, si les substrats présentant différentes énergies libres de surface sont nécessaires ou spécifiques topographies sont nécessaires. Ici, l’arrachement stress et travail de séparation des films minces fabriqués de PDMS et SSA ont été analysés avec une configuration sur mesure (dispositif de mesure adhérence macroscopique (MAD, Figure 4)). 36 l’alignement optique du substrat et avec pénétrateur est une étape essentielle pour l’analyse des résultats de la mesure. Par conséquent, réglage de l’angle d’inclinaison doit être effectuée avec le goniomètre, aussi précis que possible. C’est possible avec une précision suffisante en mettant manuellement le substrat en contact avec la surface du film jusqu'à l’obtention d’un contact horizontal.
Dans le protocole actuel, le temps d’attente était maintenu constant à une seconde (Figure 5 et Figure 7). Spécialement pour l’enquête sur la performance adhésive d’un film élastique à une surface de substrat rugueux, une prorogation du délai attente fournit des informations supplémentaires. Par exemple, une augmentation de contrainte de traction avec le temps d’attente a été rapporté8. Outre les mesures effectuées dans le protocole actuel, d’autres méthodes, par exemple essais de pelage pourraient exécuter, permettant une enquête plus approfondie d’adhérence performance37.
Les propriétés adhésives des films composites présentant le film différente épaisseurs de la colle de peau molle ont été déterminées (Figure 7). Nos résultats concordent avec les données publiées, montrant qu’une baisse de film épaisseur conduisent à une augmentation de la contrainte de traction comme le confinement, c.-à-d., le rapport entre l’épaisseur de film et le diamètre du substrat, augmentations38,39 . Basé sur ces résultats et les données représentées dans la Figure 7, nous concluons que les films composites avec une épaisseur totale d’environ 100 µm (l’épaisseur de la couche de SSA env. 60 µm, appliqué à un film PDMS avec une épaisseur d’environ 40 µm) pièce adhérence favorable p ropriétés sur des surfaces rugueuses.
Ensuite, les expériences liées à la caractérisation biologique ont été réalisées sur des films composites immaculées et plasma traité films composites (Figure 8). Traitement plasma des élastomères de silicone est une technique souvent appliquée, polyvalente pour augmenter les propriétés hydrophiles des surfaces et la promotion d’attachement cellulaire et cellulaires diffusion40,41. Silicones sont bien connus pour leur faible toxicité et biostabilité haute mais peuvent contenir des monomères résiduels ou catalyseurs susceptibles d’influencer les processus physiologiques, conduisant aussi à la cytotoxicité42,43. Dans les expériences, nous avons observé moins de cytotoxicité de 5 % à l’aide de libération de LDH comme un indicateur et un test d’exclusion bleu Trypan. Dans le protocole présenté, l’ensemble de la population cellulaire, y compris les agrégats cellulaires individuelles forme que la surface a été analysée pour l’analyse de prolifération (Figure 9 b). Une modification du protocole pourrait produire des résultats plus différenciées. Pour chaque échantillon, le surnageant contenant des agrégats cellulaires individuelles pourrait être transféré dans un tube à essais distincts et pas combiné avec les cellules enzymatiquement retirés de la surface du polymère. Cela permet l’évaluation exacte des cellules attachées à la surface et finit par révéler une détermination plus détaillée de l’influence des polymères sur le processus d’adhésion cellulaire. Outre les méthodes immunocytochimiques présentées ici, cellules pourraient être récoltées pour enquête avec des méthodes d’immunoblot, ce qui permet une évaluation quantitative détaillée d’expression de la protéine.
En résumé, nous avons établi des conditions de fabrication pour la production de composites élastomères minces pour des applications dans la recherche de culture cellulaire avancé. En outre, ces films minces possèdent haute capacité d’adaptation à la peau de rugosité, permettant la conception sophistiquée de colles de peau.

Dans le présent protocole, sont présentées des méthodes détaillées pour la fabrication de films minces d’élastomère. La technique de lame docteur largement disponibles a été utilisée pour la production de films minces de composites. La technique de fabrication a été réalisée sur des feuilles de polyethylenterephtalate (PET), permettant la production subséquente de ces films à grande échelle. L’accent du présent protocole est l’évaluation de la reproductibilité, précise de fabrication des différentes couches des films composites et détermination des propriétés biologiques et adhérence du patch composite finale. Le poly-(dimethylsiloxane) d’élastomère de silicone (PDMS) est largement utilisé dans la technologie biomédicale, y compris la production de colles de peau, microfluidique applications et recherches complémentaires champs1,2,3 ,4. Récemment, une autre sous-classe de PDMS, dite douce peau adhésifs (SSAs) ont été introduites, notamment pour la peau douce de liaison et de collage.
Silicone SSAs sont des élastomères de vinyle fonctionnalisé, différant de polymères analogues par l’absence de renforcement silice5. Semblables aux autres PDMS, SSA d’Young peut être adaptée dans une large gamme par modulation réticulant concentration ou polymérisation temps6,7,8. Ce changement de module de Young des élastomères de silicone affecte les propriétés adhésives du matériel considérablement et a également des conséquences profondes sur les cellules procaryotes et eucaryotes cultivés sur la surface9,10 , 11. au niveau biologique cellulaire, il a été démontré, que les cellules eucaryotes répondent au niveau de la transduction de signal à une modulation de l’élasticité de la matrice ou l’épaisseur de la surface9,10,12 ,13,14. Donc, il existe un large intérêt pour applications de culture de cellules de polymères ayant des propriétés mécaniques accordables. Ce qui est important, l’intrinsèquement faible énergie de surface des élastomères à base de silicone ne fournit pas des conditions optimales pour la culture cellulaire des cellules eucaryotes. Traitement au plasma oxygène est une technique largement utilisée pour augmenter le PDMS faible énergie de surface temporairement, conduisant à une amélioration de sa force de traction, a diminué l’adsorption de molécules, alors qu’en parallèle favorisant l’attachement, épandage en surface et prolifération de cellules eucaryotes15,16,17,18.
Outre les propriétés des matériaux, la topographie de surface affecte de manière significative adhésion cellulaire et l’interaction adhésive entre deux matériaux19,20,21,22. Rugosité de surface a plusieurs effets sur la formation de contact entre deux surfaces : réduction de la surface de contact, haute stocké énergie élastique entourant les aspérités ainsi que de l’influence sur la propagation de la fissure peut modifier la force d’adhérence23, 24. Adhérence de films autocollants à la peau humaine est un nouveau domaine d’application, p. ex., pansements, fixation des électrodes ECG ou autres appareils électroniques portables25,26,27, 28. Pour mesurer le rendement adhésif autocollants en ce qui concerne la topographie de la surface, des substrats de verre avec des degrés de rugosité permet l’adhérence normale mesures8,21. Ici, les deux substrats de verre ont été choisis pour étudier les propriétés adhésives des films polymères. Tout d’abord, composites films avec une couche de support du PDMS dans un rapport de 10 contre 1 poids pièces couvertes par PDMS avec rapport de mélange différente ont été caractérisés. Dans un second temps une couche adhésive de la SSA a été réalisée avec des quantités de poids égal des deux composants avec différentes épaisseurs de film sur un support film PDMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol, 97%</td>
			<td>Stockmeier Chemie</td>
			<td>1000452610000</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrasive diamnod hand pad</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>MO 5007522</td>
			<td>Grit: 220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>ACC-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraktion V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td>water soluble mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca2+, Mg2+</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum gold</td>
			<td>GE Health Care Life Science</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer OCA35</td>
			<td>Dataphysics</td>
			<td></td>
			<td>for the determination of the static water contact angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst Dye 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1155-100MG</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for cell culture documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Eclipse LV100ND</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for film thickness determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, aqueous solution 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>electron microscopy grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin und streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381-1KG</td>
			<td>Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108351397</td>
			<td>PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 basal medium</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soft skin adhesive (SSA)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108251792</td>
			<td>MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed mixer DAC 600.2 VAC-P</td>
			<td>Hauschild</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stylus profilomter</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Model: SURFCOM 1500SD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>648466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P10-023500</td>
			<td>0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV glue</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>BO MV76002</td>
			<td>medium viscosity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization

Dans ce protocole, nous présentons des méthodes pour fabriquer des films composites élastomère mince pour des applications de culture cellulaire avancé et pour le développement des adhésifs de la peau. Deux-(dimethyl siloxanes) différentes poly (PDMS et colle de peau douce (SSA)), ont été utilisés pour enquête approfondie des effets biologiques et les caractéristiques de l’adhésifs. Les films composites se composent d’une couche souple et un revêtement adhésif haut de la page. Les deux couches ont été fabriqués par la technique d’application lame docteur. Dans la présente enquête, on a étudié le comportement adhésif des films composites comme une fonction de l’épaisseur de la couche ou une variation de la module d’Young de la couche supérieure. Le module de Young de PDMS a été modifié en faisant varier la base au rapport de mélange de reticulation. En outre, l’épaisseur des films de la SSA a été varié d’environ 16 µm à environ 320 µm. Scanning electron microscope et microscopie optique ont été utilisés pour des mesures d’épaisseur. Les propriétés adhésives des films élastomère dépendent fortement de l’épaisseur du film, le module de Young des polymères et des caractéristiques de surface. Par conséquent, on a étudié adhérence normale de ces films sur des substrats de verre présentant des surfaces lisses et rugueuses. > Pull-off stress et travail de séparation sont dépendants sur le rapport de mélange d’élastomères de silicone.
En outre, l’épaisseur de la colle de peau douce placée au dessus d’une couche de soutien favorable a été modifiée afin de produire des correctifs pour les applications de la peau. La cytotoxicité, la prolifération et adhésion cellulaire des fibroblastes murins L929 sur films PDMS (mélange ratio 10:1) et SSA (mélange ratio 50/50) ont été menées. Nous ont montré ici, pour la première fois, la comparaison côte à côte des couches minces composites fabriqué de deux polymères et présenter l’étude de leurs propriétés biologiques - et adhésif.

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Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Un protocole pour le procédé de fabrication de structures composites polymères minces possédant soit Young différent modules ou épaisseurs est présenté. Films sont produits, études sur la culture cellulaire avancé ou comme adhésifs de la peau.

Mince Film silicium composites élastomères pour les Applications de la peau et de Culture cellulaire : fabrication et caractérisation

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

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