Name: thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00
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Martin Danner ist bekannt für seine Hilfe bei der Vorbereitung von Proben und Definition der Zelle Kultur Verfahren anerkannt. Die Autoren möchten Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Deutschland), vor allem Robert Radsziwill für kontinuierliche Unterstützung und Diskussionen zu danken. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell vom European Research Council unter EU Fp7 (FP/2007-2013) ERC Grant Agreement n. 340929.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Design der composite-Strukturen ermöglicht die einfache Anpassung der Materialeigenschaften, wie des Elastizitätsmoduls oder die Dicke der Proben. Elastizitätsmodul von PDMS kann effektiv in einem breiten Spektrum durch das Mischungsverhältnis zwischen den beiden Komponenten zu verändern oder die Herstellung der Mischungen mit einem unterschiedlichen Silikon Elastomer30,31geändert werden. Die beschriebenen Methoden sind nicht beschränkt auf die PDMS in dieser Untersuchung verwendet, aber vor allem die selbstklebende Leistung hängt stark von der spezifischen Art verwendet. Ein wichtiger Schritt innerhalb dieses Protokolls ist der Herstellungsprozess von Verbundfolien (Abbildung 1). Es zeigte sich, dass die Dicke der Filme erheblich beeinträchtigt die Haftung Verhalten der Filme auf verschiedenen Substraten, einschließlich Haut (Abbildung 5 und Abbildung 6). Neben der Foliendicke Zeit und Temperatur während des Trocknungsprozesses wirkt sich die Materialeigenschaften32. Parameter wie die Dicke der Polymeren Schichten müssen daher sorgfältig angepasst und überprüft werden.
Analyse der selbstklebenden Eigenschaften dünner Schichten erfolgte mit Normalkraft Adhäsion Messungen mit zwei Glassubstraten mit verschiedenen Rauheit der Oberfläche bis zu Ra = 0.338 µm (Abbildung 3). Im Allgemeinen wirkt Rauheit deutlich die Haftung von Oberflächen, insbesondere von elastischen Materialien33,34. Die Rauheit des Glases kann leicht variiert werden, durch Schleifen mit Schleifpapier verschiedener Schroffheit Größen, daher erlauben die Herstellung von Substraten, die höhere Rauheit Werte21ausstellen. Darüber hinaus andere Materialien, z.B. Epoxidharz für die Herstellung von Substraten15,35einsetzbar. Dies könnte eine wichtige Modifikation Strategie des vorliegenden Protokolls sein. Zum Beispiel wenn Substrate mit verschiedenen Oberflächen freie Energien benötigt oder spezielle sind Topographien erforderlich. Hier wurden abziehen Stress und der Trennung von den Dünnschichten des PDMS und SSA hergestellt mit einem maßgeschneiderten Setup (makroskopische Adhäsion Messgerät (MAD, Abbildung 4)) analysiert. 36 optische Ausrichtung des Substrats und Eindringkörper ist ein entscheidender Schritt für die Analyse der Messergebnisse. Einstellung des Neigungswinkels muss daher mit dem Goniometer, so präzise wie möglich durchgeführt werden. Dies kann mit ausreichender Genauigkeit erreicht werden, indem Sie manuell das Substrat in Kontakt mit der filmoberfläche bis ein horizontale Kontakt entsteht.
Das aktuelle Protokoll wurde die Haltezeit auf eine Sekunde (Abbildung 5 und Abbildung 7) konstant gehalten. Vor allem für die Untersuchung der Klebstoff Leistung einen elastischen Film auf eine grobe Substratoberfläche stellt eine Erweiterung der Haltezeit Zusatzinformationen. Zum Beispiel wurde eine Zunahme der abziehen Stress mit zunehmendem Haltezeit gemeldeten8. Neben der Messungen in das aktuelle Protokoll, andere Methoden könnte zum Beispiel Peel Tests durchgeführt werden ermöglicht eine umfassendere Untersuchung der Haftung Leistung37.
Die Hafteigenschaften von Verbundfolien ausstellen anderen Film, die Dicke des Klebers weiche Haut ermittelt wurden (Abbildung 7). Unsere Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten zeigen, dass eine Abnahme der Film Dicke führen zu einer Erhöhung der Belastung abziehen wie die Entbindung, d.h., das Verhältnis zwischen Durchmesser und Film Substratdicke, erhöht38,39 . Basierend auf diesen Ergebnissen und die Daten, die in Abbildung 7dargestellt, schließen wir, dass Verbundfolien mit einer Gesamtdicke von ca. 100 µm (Dicke der SSA-Schicht von ca. 60 µm aufgetragen zu einem PDMS-Film mit einer Dicke von ca. 40 µm) günstige Adhäsion p ausstellen Roperties auf rauen Oberflächen.
Als nächstes Experimente im Zusammenhang mit der biologischen Charakterisierung auf unberührten Verbundfolien durchgeführt wurden und Plasma behandelt Verbundfolien (Abbildung 8). Plasmabehandlung von Silikon-Elastomeren ist eine häufig angewandte, vielseitige Technik, um die hydrophilen Eigenschaften von Oberflächen und Förderung der zellulären Anlage und Mobilfunk Verbreitung40,41zu erhöhen. Silikone sind bekannt für ihre geringe Toxizität und hohe-Kompatibilität aber enthält möglicherweise Restmonomere oder Katalysatoren, die physiologische Prozesse, was auch zu Zytotoxizität42,43beeinflussen könnten. In die Experimente, die wir beobachtet haben, weniger als 5 % Zytotoxizität mit LDH Version als Indikator und ein Trypan blau-Ausschluss-Assay. Im vorgestellten Protokoll der gesamten zellulären Bevölkerung getrennt zellulären Aggregate einschließlich Form, die die Oberfläche für die Verbreitung Analyse (Abbildung 9 b) analysiert wurde. Eine Änderung des Protokolls könnte mehr differenzierte Ergebnisse produzieren. Für jede Probe konnte der Überstand mit freistehenden zellulären Aggregate auf einem separaten Reaktionsgefäß übertragen und nicht in Kombination mit der Zellen enzymatisch aus der Polymeroberfläche entfernt. Dies ermöglicht die genaue Beurteilung der Zellen an der Oberfläche befestigt und schließlich offenbaren eine genauere Bestimmung des Einflusses der Polymere auf die zelluläre Klebevorgang. Neben den hier vorgestellten Immunocytochemical Methoden möglicherweise Zellen für die Untersuchung mit Immunoblot Methoden, so dass eine detaillierte quantitative Bewertung der Proteinexpression geerntet werden.
Zusammenfassend haben wir Herstellungsbedingungen für die Herstellung von dünnen Elastomeren Verbundfolien für Anwendungen in der fortgeschrittenen Kultur Zellforschung etabliert. Darüber hinaus besitzen diese Dünnfilme hohen Anpassungsfähigkeit auf Haut, Rauheit, anspruchsvolles Design der Haut Klebstoffe ermöglichen.

In diesem Protokoll werden detaillierte Methoden für die Herstellung von dünnen Elastomer Filme vorgestellt. Die allgemein verfügbaren Arzt Klinge Technik wurde für die Herstellung von dünnen Verbundfolien eingesetzt. Die Herstellungstechnik wurde auf Polyethylenterephtalate (PET) Folien, spätere Produktion dieser Filme in großem Maßstab durchgeführt. Schwerpunkt dieses Protokolls ist die Bewertung der Reproduzierbarkeit, präzise Herstellung von den verschiedenen Schichten der Verbundfolien und Bestimmung der biologischen und Adhäsion Eigenschaften des endgültigen zusammengesetzte Patches. Die Silikon-Elastomer-poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) wird weitgehend verwendet in der biomedizinischen Technologie, einschließlich der Herstellung von Haut-Klebstoffen, Mikrofluidik Anwendungen und zusätzliche Forschung Felder1,2,3 ,4. Vor kurzem, eine andere Unterklasse von PDMS, so genannte weiche Haut Klebstoffe (SSAs) wurden eingeführt, insbesondere für sanfte Haut kleben und de-bonding.
Silikon-SSAs sind Vinyl funktionalisiert Elastomere, abweichend von Analog Polymere durch den Mangel an Kieselsäure5zu stärken. Ähnlich wie bei anderen PDMS, SSA kann Elastizitätsmodul in einem breiten Spektrum von modulierenden Vernetzer Konzentration oder heilende Zeit6,7,8angepasst werden. Diese Veränderung des Elastizitätsmoduls von Siliconelastomeren die klebtechnischen Eigenschaften des Materials erheblich beeinträchtigt und hat auch tiefgreifende Auswirkungen auf die prokaryotischen und eukaryotischen Zellen kultiviert auf der Oberfläche9,10 , 11. auf der Zellebene biologische wurde gezeigt, daß Eukaryotische Zellen reagieren auf den Signalpegel Transduktion zu einer Modulation der Matrix Elastizität oder Dicke der Oberfläche9,10,12 ,13,14. Daher ein breites Interesse in Zelle Kultur Anwendungen von Polymeren mit einstellbaren mechanischen Eigenschaften vorhanden. Wichtig ist, bietet intrinsisch niedrige Oberflächenenergie von Siliconelastomeren basiert nicht optimale Bedingungen für die Zellkultur von eukaryotischen Zellen. Sauerstoff-Plasma-Behandlung ist eine weit verbreitete Technik, PDMS niedrige Oberflächenenergie vorübergehend, führt zu einer Steigerung der Haftzugfestigkeit erhöhen verringerte Oberfläche Adsorption von Molekülen, während parallel Anlage, Verbreitung zu fördern und Verbreitung von eukaryotischen Zellen15,16,17,18.
Neben den Materialeigenschaften beeinträchtigt der Oberflächentopographie erheblich, zelluläre Adhäsion und die selbstklebende Interaktion zwischen zwei Materialien19,20,21,22. Rauheit der Oberfläche hat verschiedene Auswirkungen auf die Kontakt zwischen zwei Flächen: Reduktion der Kontaktfläche, hohe gespeicherte elastische Energie rund um Unebenheiten sowie Einfluss auf die Rissausbreitung Haftfestigkeit23, verändern kann 24. Haftung von selbstklebenden Folien auf die menschliche Haut ist ein aufstrebendes Gebiet der Anwendung, z. B. Wundauflagen, Fixierung der EKG-Elektroden oder andere tragbare elektronische Geräte25,26,27, 28. Um den Klebstoff Leistungsmessung von selbst-Klebstoffen in Bezug auf Topographie können Glassubstrate mit unterschiedlichem Grad der Rauheit im normalen Adhäsion Messungen8,21verwendet werden. Hier wurden zwei Glassubstraten ausgewählt, um die Hafteigenschaften von Polymerfolien untersuchen. Zeichneten sich erste, zusammengesetzte Filme mit einer Trägerschicht PDMS im Mischungsverhältnis 10: 1 Gewicht Teile mit unterschiedlichen Mischungsverhältnis von PDMS abgedeckt. In einem zweiten Schritt wurde eine Klebeschicht SSA mit gleichem Gewicht Mengen beider Komponenten und mit unterschiedlichen Schichtdicken auf PDMS Vorfilm vorbereitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol, 97%</td>
			<td>Stockmeier Chemie</td>
			<td>1000452610000</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrasive diamnod hand pad</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>MO 5007522</td>
			<td>Grit: 220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>ACC-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraktion V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td>water soluble mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca2+, Mg2+</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum gold</td>
			<td>GE Health Care Life Science</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer OCA35</td>
			<td>Dataphysics</td>
			<td></td>
			<td>for the determination of the static water contact angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst Dye 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1155-100MG</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for cell culture documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Eclipse LV100ND</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for film thickness determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, aqueous solution 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>electron microscopy grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin und streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381-1KG</td>
			<td>Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108351397</td>
			<td>PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 basal medium</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soft skin adhesive (SSA)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108251792</td>
			<td>MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed mixer DAC 600.2 VAC-P</td>
			<td>Hauschild</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stylus profilomter</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Model: SURFCOM 1500SD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>648466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P10-023500</td>
			<td>0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV glue</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>BO MV76002</td>
			<td>medium viscosity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization

In diesem Protokoll präsentieren wir Methoden, um dünne Elastomer Verbundfolien für fortgeschrittene Zelle Kultur Anwendungen und für die Entwicklung der Haut Klebstoffe zu fabrizieren. Zwei verschiedene Poly--(dimethyl siloxanes) (PDMS und weiche Haut Klebstoff (SSA)), werden seit in tiefe Untersuchung von biologischen Wirkungen und Hafteigenschaften. Die Verbundfolien bestehen aus einer flexiblen Trägerschicht und eine selbstklebende Deckschicht. Beide Schichten wurden durch Arzt Klinge Applikationstechnik hergestellt. In der vorliegenden Untersuchung ist der Klebstoffe Verhalten der Verbundfolien als Funktion der Schichtdicke oder eine Variation des Elastizitätsmoduls der obersten Ebene untersucht worden. Der Elastizitätsmodul des PDMS wurde geändert durch Variation der Ausgangspunkt, um Vernetzer Mischungsverhältnis. Darüber hinaus die Dicke der SSA Filmen variierte von ca. 16 µm bis ca. 320 µm. Scanning Electron Microscopy (SEM) und optische Mikroskopie für Dickenmessung verwendet worden. Die Hafteigenschaften der Elastomer-Filme hängen stark von der Schichtdicke, der Elastizitätsmodul von Polymeren und Oberflächeneigenschaften. Also, normale Haftung dieser Filme auf Glassubstraten mit glatten und rauen Oberflächen untersucht worden ist. Abziehen-Stress und Arbeit der Trennung sind abhängig von dem Mischungsverhältnis von Siliconelastomeren.
Außerdem variierte die Dicke der weiche Hautkleber auf eine Unterstützende Trägerschicht platziert um Patches für Haut Anwendungen zu produzieren. Zytotoxizität, Verbreitung und zelluläre Adhäsion L929 murine Fibroblasten auf PDMS Filme (Mischungsverhältnis 10:1) und SSA-Filme (Verhältnis 50: 50 mischen) wurden durchgeführt. Wir haben hier zum ersten Mal die Gegenüberstellung von zusammengesetzten Dünnfilmen beide Polymere hergestellt gezeigt und die Untersuchung ihrer biologischen und Klebstoff Eigenschaften präsentieren.

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Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Ein Protokoll für die Herstellung von Polymeren Dünnschicht Verbundstrukturen besitzen unterschiedliche Youngs Moduli oder dicken wird vorgestellt. Filme sind für fortgeschrittene Zelle Kulturwissenschaft oder als Haut Klebstoffe hergestellt.

Dünnen Film Composite Silikon Elastomere für Zellkultur und Haut Anwendungen: Herstellung und Charakterisierung

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

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Forschung

Entwicklungsbiologie

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