Name: thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00
Duration: 8 min 2 s
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Martin Danner è riconosciuto per la sua assistenza nella preparazione di campioni e istituzione di procedure di coltura delle cellule. Gli autori vorrei ringraziare Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Amburgo, Germania), soprattutto Robert Radsziwill per il continuo supporto e discussioni. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP/2007-2013) convenzione di sovvenzione CER n. dell'Unione europea 340929.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La progettazione di strutture in composito consente la semplice regolazione delle proprietà dei materiali, come il modulo di Young o lo spessore dei campioni. Il modulo di Young di PDMS può essere cambiato in modo efficace in una vasta gamma alterando il rapporto di miscelazione tra i due componenti o fabbricazione di miscele utilizzando un diverso in silicone elastomero30,31. I metodi descritti non sono limitati al PDMS utilizzato nella presente inchiesta, ma soprattutto la prestazione adesiva dipende fortemente il tipo specifico utilizzato. Un passaggio fondamentale nell'ambito di questo protocollo è il processo di produzione dei film composito (Figura 1). È stato dimostrato che lo spessore dei film incide considerevolmente il comportamento di adesione dei film su diversi substrati, tra cui la pelle (Figura 5 e Figura 6). Oltre lo spessore del film, ora e temperatura durante il processo di polimerizzazione riguarda la proprietà del materiale32. Pertanto, parametri come lo spessore degli strati polimerici devono essere attentamente adattato e verificato.
Analisi delle proprietà adesive delle pellicole sottili è stata eseguita con misure di adesione di forza normale utilizzando due substrati di vetro con diverse rugosità fino a Ra = 0.338 µm (Figura 3). In generale, la rugosità influisce significativamente l'adesione delle superfici, soprattutto di materiali elastici33,34. La rugosità di vetro può essere facilmente variata di levigatura con carta vetrata di dimensioni diverse asperità, consentendo quindi la realizzazione di substrati esibendo i più alti valori di rugosità21. In aggiunta, altri materiali, ad esempio resina epossidica può essere utilizzata per la produzione di substrati15,35. Questo potrebbe essere una strategia importante modifica del protocollo presentato. Ad esempio, se substrati che esibiscono diverse superficie libera energie sono necessari o specifiche Topografie sono necessarie. Qui, pull-off stress e lavoro di separazione delle pellicole sottili prodotte di PDMS e SSA sono stati analizzati con un programma di installazione su misura (dispositivo di misurazione macroscopica adesione (MAD, Figura 4)). 36 l'allineamento ottico del substrato e penetratore è un passo fondamentale per l'analisi dei risultati delle misurazioni. Di conseguenza, regolazione dell'angolo di inclinazione deve essere eseguita con il goniometro, più preciso possibile. Ciò può essere ottenuto con sufficiente precisione manualmente portando il substrato a contatto con la superficie della pellicola fino a quando si ottiene un contatto orizzontale.
Nel protocollo attuale il tempo di attesa è stato mantenuto costante a un secondo (Figura 5 e Figura 7). Soprattutto per la ricerca delle prestazioni adesiva di un film elastico per una superficie di substrato grezzo, un'estensione del tempo di attesa fornisce informazioni aggiuntive. Ad esempio, un aumento nello sforzo di strappo con l'aumento del tempo di attesa è stato segnalato8. Oltre le misure eseguite nel protocollo attuale, altri metodi, ad esempio peel test potrebbe essere effettuato, permettendo una più vasta inchiesta di adesione prestazioni37.
Le proprietà adesive del film compositi che esibiscono differenti della pellicola sono stati determinati spessori dell'adesivo pelle morbida (Figura 7). I nostri risultati sono in linea con i dati pubblicati, che con un decremento di piombo di spessore di pellicola ad un aumento dello stress pull-off come il confinamento, cioè, il rapporto tra diametro e pellicola spessore del substrato, aumenti38,39 . Basato su questi risultati e i dati rappresentati in Figura 7, concludiamo che film compositi con uno spessore totale di circa 100 µm (spessore dello strato SSA di circa 60 µm applicato ad una pellicola PDMS con uno spessore di circa 40 µm) esibiscono favorevole adesione p roprietà su superfici ruvide.
Successivamente, sul film compositi incontaminate sono stati eseguiti esperimenti relazionati alla caratterizzazione biologica e trattate al plasma film compositi (Figura 8). Trattamento al plasma di elastomeri di silicone è una tecnica versatile, spesso applicata per aumentare le proprietà idrofile di superfici e promuovere attaccamento cellulare e cellulare diffusione40,41. Siliconi sono ben noti per la loro bassa tossicità e biostabilità alta ma possono contenere di monomeri residui o catalizzatori in grado di influenzare processi fisiologici, che conduce anche a citotossicità42,43. Nell'esperimenti condotti abbiamo osservato a meno di 5% citotossicità con rilascio di LDH come un indicatore e un test di esclusione del Trypan Blue. Nel protocollo presentato, l'intera popolazione cellulare, tra cui aggregati cellulari indipendente forma che la superficie è stata analizzata per analisi di proliferazione (figura 9B). Una modifica del protocollo potrebbe produrre risultati più differenziati. Per ciascun campione, il supernatante contenente aggregati cellulari indipendenti potrebbe essere trasferito in una provetta di reazione separata e non combinato con le cellule enzimaticamente rimosse dalla superficie del polimero. Ciò consente l'esatta determinazione delle cellule attaccate alla superficie e alla fine rivelano una più dettagliata valutazione dell'influenza dei polimeri sul processo di adesione cellulare. Oltre ai metodi di immunocytochemical ha presentati qui, le cellule potrebbero essere raccolte per indagine con metodi di immunoblot, permettendo una valutazione quantitativa dettagliata dell'espressione della proteina.
In sintesi, abbiamo stabilito le condizioni di produzione per la produzione di film sottili di compositi elastomerici per applicazioni in ricerca della coltura avanzata delle cellule. Inoltre, questi film sottili possiedono alta adattabilità alla pelle rugosità, consentendo il sofisticato design degli adesivi di pelle.

In questo protocollo, sono presentati metodi dettagliati per la produzione di film sottile elastomero. La tecnica di lama medico ampiamente disponibile è stata utilizzata per la produzione di film sottili di composito. La tecnica di fabbricazione è stata effettuata su fogli di polietilentereftalato (PET), che consente la produzione successiva di questi film in larga scala. L'enfasi di questo protocollo è la valutazione della riproducibilità, precisa produzione di diversi strati di film compositi e determinazione delle proprietà biologiche e adesione della patch composito finale. Il poly-(dimethylsiloxane) di elastomero di silicone (PDMS) è ampiamente utilizzato nella tecnologia biomedica, compresa la produzione di pelle adesivi, applicazioni di microfluidica e ulteriori ricerche campi1,2,3 ,4. Recentemente, un'altra sottoclasse di PDMS, i cosiddetti Soft pelle adesivi (SSAs) sono stati introdotti, in particolare per la pelle delicata di legame e de-bonding.
SSAs in silicone sono elastomeri vinile funzionalizzato, differiscono dai polimeri analoghe dall'assenza di silice5di rinforzo. Simile a altri PDMS, SSA modulo di Young può essere adattato in una vasta gamma di concentrazione cross-linker modulante o polimerizzazione tempo6,7,8. Questo cambiamento di modulo di Young di elastomeri di silicone influisce in modo significativo le proprietà adesive del materiale e ha anche profonde conseguenze sulle cellule procariote ed eucariote coltivate sulla superficie9,10 , 11. il livello biologico cellulare, è stato dimostrato, che le cellule eucariotiche rispondono sul livello di trasduzione del segnale per una modulazione dell'elasticità matrice o spessore della superficie9,10,12 ,13,14. Di conseguenza, esiste un vasto interesse nelle applicazioni della coltura delle cellule di polimeri con proprietà meccaniche sintonizzabile. D'importanza, l'intrinsecamente bassa energia superficiale degli elastomeri a base di silicone non fornisce le condizioni ottimali per la coltura cellulare delle cellule eucariotiche. Trattamento al plasma di ossigeno è una tecnica ampiamente utilizzata per aumentare PDMS bassa energia superficiale temporaneamente, che porta ad un potenziamento della sua forza di strappo, diminuita superficie adsorbimento di molecole, mentre in parallelo promuovere attaccamento, diffusione e proliferazione di cellule eucariotiche15,16,17,18.
Oltre alle proprietà dei materiali, la topografia di superficie influenza in modo significativo di adesione cellulare e l'interazione adesivo tra due materiali19,20,21,22. Rugosità superficiale ha parecchi effetti sulla formazione contatto tra due superfici: riduzione della zona di contatto, alta memorizzati energia elastica che circonda asperità così come influenza sulla propagazione di crepa può alterare la resistenza adesiva23, 24. Adesione di pellicole autoadesive per la pelle umana è un settore emergente di applicazione, ad esempio, medicazioni, fissazione di elettrodi ECG o altri dispositivi elettronici indossabili25,26,27, 28. Per misurare la prestazione adesiva di autoadesivi in relazione alla topografia superficiale, substrati di vetro con diversi gradi di rugosità possono essere utilizzati nella normale adesione misure8,21. Qui, i due substrati di vetro sono stati selezionati per indagare le proprietà adesive delle pellicole polimeriche. Composito, primo film con un strato di rinforzo PDMS in un rapporto di 10 a 1 peso parti coperte da PDMS con diverso rapporto di miscelazione miscelazione sono state caratterizzate. In una seconda fase uno strato adesivo di SSA è stato preparato con una quantità di peso uguale di entrambi i componenti e con vario spessore di pellicola sopra un supporto film PDMS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol, 97%</td>
			<td>Stockmeier Chemie</td>
			<td>1000452610000</td>
			<td>Isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrasive diamnod hand pad</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>MO 5007522</td>
			<td>Grit: 220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>ACC-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraktion V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td>water soluble mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca2+, Mg2+</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum gold</td>
			<td>GE Health Care Life Science</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer OCA35</td>
			<td>Dataphysics</td>
			<td></td>
			<td>for the determination of the static water contact angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst Dye 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1155-100MG</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for cell culture documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Eclipse LV100ND</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope used for film thickness determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, aqueous solution 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>electron microscopy grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin und streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381-1KG</td>
			<td>Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108351397</td>
			<td>PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 basal medium</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soft skin adhesive (SSA)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>(400)000108251792</td>
			<td>MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed mixer DAC 600.2 VAC-P</td>
			<td>Hauschild</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stylus profilomter</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Model: SURFCOM 1500SD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M200 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>648466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P10-023500</td>
			<td>0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV glue</td>
			<td>Bohle</td>
			<td>BO MV76002</td>
			<td>medium viscosity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin film composite silicon elastomers for cell culture and skin applications: manufacturing and characterization

In questo protocollo, presentiamo metodi per fabbricare film composito sottile in elastomero per applicazioni della coltura avanzata delle cellule e per lo sviluppo di adesivi di pelle. Due diversi poli-(dimethyl siloxanes) (PDMS e morbida pelle adesivo (SSA)), sono stati utilizzati per indagini approfondite di effetti biologici e caratteristiche adesive. Il film compositi sono costituiti da uno strato di supporto flessibile e un rivestimento superiore adesivo. Entrambi gli strati sono stati fabbricati dalla tecnica di applicazione lama medico. Nella ricerca attuale, il comportamento adesivo dei film composito è stato studiato come una funzione di spessore dello strato o una variazione del modulo di Young del livello superiore. Il modulo di Young di PDMS è stato modificato variando la base per il rapporto di miscelazione di reticolante. Inoltre, lo spessore del film di SSA è stato variato da circa 16 µm a circa 320 µm. scansione microscopia elettronica (SEM) e microscopia ottica sono stati utilizzati per misure di spessore. Le proprietà adesive del film elastomero dipendono fortemente lo spessore del film, il modulo di Young dei polimeri e le caratteristiche superficiali. Di conseguenza, è stato studiato normale adesione di questi film su substrati di vetro che esibiscono le superfici lisce e ruvide. Il rapporto di miscelazione di elastomeri di silicone dipendono strappo stress e lavoro di separazione.
Inoltre, lo spessore dell'adesivo pelle morbida posizionato sopra uno strato di appoggio solidale è stato variato per produrre le patch per le applicazioni della pelle. Citotossicità, proliferazione e adesione cellulare dei fibroblasti murini L929 su pellicole di PDMS (rapporto di miscelazione 10:1) e SSA (miscelazione rapporto 50: 50) sono stati condotti. Ci hanno mostrato qui, per la prima volta, il confronto fianco a fianco di sottili pellicole compositi prodotte di entrambi polimeri e presentare lo studio delle loro proprietà biologiche - e adesivo.

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Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Un protocollo per il processo di fabbricazione di strutture in composito polimerico pellicola sottile che possiede di diversi giovani moduli o spessori è presentato. Film sono prodotti per studi su colture cellulari avanzati o come adesivi di pelle.

Thin Film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

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