Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

رعاية الحيوان الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نييهس) واستخدام اللجنة (أكوك) وافقت جميع منهجية هذه الدراسة تحت "إييدل اقتراح دراسة الحيوان نييهس" 05-46.
1-جمع الأنسجة الأمثل لليزر ميكروديسيكشن
<ol><li>الحصول على 2 للفئران عمرها 3 أشهر، ذكرا كان أو أنثى C57BL/6. Euthanize مع CO2 لحد أد?...

TM يلعب دوراً حيويا في الحفاظ على نشاط IOP التماثل الساكن وبه خلل مقبول على نطاق واسع كالعامل الرئيسي المسبّب لارتفاع ضغط الدم الزرق1،2،19. قد تم ربط عدد من النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة في عدة جينات حددها تحليل جوس الزرق زيادة ال...

الزرق هو مجموعة من الأمراض التي تتميز باعتلال الأعصاب البصرية واعتلال الشبكية الذي يؤدي في النهاية إلى العمى لا رجعة فيه1،2. ومن المقدر أن يعيش قبل عام 2020 ما يزيد على 70 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع بعض أشكال المرض3،4،5،،من67. زاوية مفتوحة الابتدائي الزرق (باغ)، النوع الأكثر شيوعاً من الزرق، تتميز بانخفاض في التدفق المائي الفكاهة (AH) مما يؤدي إلى زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)8،،من910، 11،13،،من121415،3،16،،من1718. غادر IOP غير المعالجة، وارتفاع مزمن يؤدي إلى الضرر التدريجي والذي لا رجعة فيه للشبكية والعصب البصري رئيس تسبب العمى شعاعي،1،2،19. جميع الأساليب الحالية لتباطؤ التقدم من الزرق التركيز على تخفيف IOP، أما عن طريق خفض معدل إنتاج AH بالجسم الهدبي أو تعزيز أنها تدفق1،،من89، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-ميشوورك ترابيكولار (TM) يلعب دوراً حيويا في تنظيم نشاط في مسار تدفق آه الأولية ووظيفتها غير السليمة أحد عوامل مسببة لفرط ضغط الدم الزرق1،2،19. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة بخلل TM وكيف ينظم آه الصرف ليست بعد تماما مفهومة وحاليا محورا أساسيا الزرق البحوث1،2،19، 20-في حين ربطت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جوس) عددا من الجينات الزرق، وزيادة المقاومة لمرفق تدفق آه في TM، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى المرض لم يفهم بعد تماما21 , 22 , 23 , 24 , 25.
نماذج حيوانية عززت إلى حد كبير معارفنا الحالية من تطور المرض في الزرق (استعراض على نطاق واسع في3،15،،من1626،،من2728، 29،،من3031،،من3233). تم وضع عدة طرق رائدة لدراسة ال35،،من34TM36 وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لتعزيز فهمنا الحالي للأنسجة المريضة وطبيعية. واحد المجالات التي لم تستكشف على نطاق واسع هو استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة الآليات الجزيئية لفشل TM. وقد تدق المعدلة وراثيا في والماوس المغلوب دراسات الجينات TM المرتبطين بها، مثل ميسلين (ميوك)37،38 و39من Cyp1b1، الأدوات الأساسية لدراسة الآليات الجزيئية للخرائط المواضيعية الدالة. ومن المفهوم أن حجم TM في الفئران الصغيرة يمثل عقبة خطيرة يجب التغلب عليها من أجل البدء بدراسة هذا النسيج. نماذج الماوس تمثل أداة قوية لدراسة علم الوراثة والآليات الجزيئية للمرض، بينما التقدم في تكنولوجيات LCM توفير الأدوات اللازمة لتمكين دراسة الأنسجة أصغر وأدق، بما في ذلك TM.
في هذا التقرير، يرد طريقة قوية واستنساخه ل LCM ل TM التخصيب من عيون الماوس جنبا إلى جنب مع عزل الحمض النووي الريبي اللاحقة، وتضخيم لتحليل التعبير المتلقين للمعلومات. أساليب مماثلة قد استخدمت بنجاح في الفئران لعزل أنواع أخرى من العين الأنسجة40،41،42،،من4344، ويمكن تطبيق المنهجية التي ذكرت هنا للآخر منفصلة من أنسجة العين لدراسة الحمض النووي الريبي، ميكرورنا والحمض النووي والبروتينات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لتحسين فهم الآلية المرضية الجزيئية للعاهات TM في الزرق، وأمراض العين3،،من1516،17 ،،من1826،31،،من4546. وستكون القدرة على عزل TM عيون الفأر من LCM تقنية مفيدة في الحصول على المزيد من رؤى في الآليات الجزيئية لعدة أمراض العين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) يسمح بتحليل التعبير الجيني للخلايا المفردة وأثرى السكان خلية في أقسام الأنسجة. LCM أداة عظيمة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا والتنمية والتقدم لمختلف الأمراض، بما في ذلك المياه الزرقاء. الزرق، التي تضم أسرة من اعتلالات الأعصاب البصرية التدريجي، السبب الأكثر شيوعاً للعمى لا رجعة فيها في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)، وعامل خطر رئيسي لتطوير الزرق التغييرات الهيكلية والأضرار داخل ميشوورك ترابيكولار (TM). ومع ذلك، هي لا تزال غير مفهومة الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك. القدرة على إجراء تحليل التعبير الجيني سيكون حاسما في الحصول على المزيد من رؤى في وظيفة هذه الخلايا ودورها في تنظيم التنمية IOP والزرق. لتحقيق هذا الهدف، إثراء أسلوب استنساخه لعزل عالية TM من المقاطع المجمدة عيون الماوس وطريقة لتحليل التعبير الجيني المتلقين للمعلومات، مثل كما هو مطلوب RT-قبكر وتسلسل الحمض النووي الريبي. تم تطوير الطريقة الموضحة هنا لعزل TM نقية جداً من عيون الماوس PCR المتلقين للمعلومات الرقمية وتحليل ميكرواري. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل خلايا العين التخصيب والمقصورات الخلية التي كان من الصعب على عزل من عيون الماوس الأخرى. أن الجمع بين التحليل LCM والجيش الملكي النيبالي يمكن أن تسهم في فهم أكثر شمولاً للأحداث الخلوية الكامنة وراء الزرق.

LCM جمعت الجيش الملكي النيبالي من TM والجسم الهدبي من الفئران مختلفة 4 معزولة من أجل أن تكون قادرة على تحليل التعبير الجيني ومقارنة التعبير مع ذلك في العين كلها والصلبة والقزحية، الشبكية، والقرنية والعدسة المعزولة من الفئران منفصلة ثلاثة. TM التعبير عن الجينات، ميوك<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

هنا، نحن وصف بروتوكول ميكروديسيكشن التقاط ليزر استنساخه (LCM) لعزل trabecular ميشوورك (TM) لتحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات. القدرة على تحليل التغيرات في التعبير الجيني في TM سوف تساعد في فهم الآليات الجزيئية الكامنة لأمراض العين المتعلقة بالخرائط المواضيعية.

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...