Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Het National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care en gebruik Comité (ACUC) goedgekeurd alle methodologie van dit onderzoek onder de NIEHS dier studeren voorstel IIDL 05-46.
1. optimale weefsel collectie voor Laser Microdissection
<ol><li>Verkrijgen van 2 naar 3-maand oude muizen, mannelijk of vrouwelijk C57BL/6. Euthanaseren met CO2 voor een minimum van 1 min of totdat ademhaling heeft opgehouden. Verwijderen van het dier uit de kooi en dood door cervica...

De TM speelt een vitale rol in het actief onderhouden homeostatische IOP en zijn dysfunctie wordt algemeen erkend als de belangrijkste oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Een aantal single nucleotide polymorphisms in verschillende genen geïdentificeerd door GWAS analyse zijn gekoppeld aan verhoogde glaucoom risico en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM; echter, de exacte moleculai...

Glaucoom is een groep van ziekten gekenmerkt door optische neuropathie en retinopathie die uiteindelijk tot onomkeerbare blindheid1,2 leidt. Geschat wordt dat door 2020 meer dan 70 miljoen mensen wereldwijd moeten met een vorm van de ziekte3,4,5,6,7 leven zal. Primaire open hoek glaucoom (POAG), het meest voorkomende type glaucoom, wordt gekenmerkt door een daling in aqueous humor (AH) uitstroom leidt tot verhoogde intraoculaire druk (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Linker onbehandeld, chronisch verhoogde IOP leidt tot progressieve en onomkeerbare schade aan de retina en oogzenuw hoofd veroorzaakt radiale blindheid1,2,19. Alle huidige methoden voor het vertragen van de progressie van glaucoom focus op vermindering van de IOP, hetzij door het verminderen van het percentage van de productie van AH door het straalvormig lichaam of verbetering van het uitstroom1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. het trabecular gevlochten (TM) speelt een cruciale rol bij het reguleren van de primaire AH uitstroom pathway actief en zijn onjuiste functie is een oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Echter de moleculaire mechanismen gekoppeld TM dysfunctie en hoe regelt het AH drainage worden nog niet volledig begrepen en is momenteel een belangrijk aandachtspunt van glaucoom onderzoek1,2,19, 20. terwijl verschillende genoom-brede vereniging studies (GWAS) een aantal genen aan glaucoom en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM hebt gekoppeld, de exacte moleculaire mechanismen die leiden tot de ziekte niet nog volledig begrepen21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Dierlijke modellen hebben aanzienlijk verbeterd onze huidige kennis van de progressie van de ziekte in glaucoom (uitgebreid herzien in3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Verschillende baanbrekende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de TM34,35,,36 en deze methoden hebben wijd verbeid gebruikt om ons huidige begrip van normale en zieke weefsel. Een gebied dat is niet uitgebreid onderzocht is het gebruik van genetisch gemodificeerde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM mislukking. Transgene knock-in en knock-out muis studies van TM verbonden genen, zoals Myocilin (Myoc)37,38 en39van het Cyp1b1, zijn de belangrijkste instrumenten voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM functie. Begrijpelijk, de geringe omvang van de TM in muizen vertegenwoordigt een ernstige hindernis die moet worden overwonnen om te beginnen met het bestuderen van dit weefsel. Muismodellen vertegenwoordigen een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de genetica en de moleculaire mechanismen van ziekte, hoewel de vooruitgang in de LCM technologieën bieden de noodzakelijke hulpmiddelen om de studie van de kleinste en meest delicate weefsels, met inbegrip van de TM machtigen.
In dit verslag wordt een robuust en reproduceerbare methode beschreven voor de LCM van hoogverrijkt TM van muis ogen samen met de latere RNA isolatie en versterking voor downstream expressie analyse. Soortgelijke methoden hebben met succes gebruikt bij muizen te isoleren van andere soorten oog weefsels40,41,42,43,44, de methodologie die hierin gemeld kan worden toegepast op andere discrete weefsels van het oog om te studeren van RNA, microRNA, DNA en proteïnen. Belangrijk is dat maakt deze techniek het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen voor een beter begrip van de moleculaire pathogenese van TM waardevermindering in glaucoom en oculaire ziekte3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. De mogelijkheid om te isoleren van de TM van muis ogen door LCM zullen een handige techniek bij het verkrijgen van meer inzicht in de moleculaire mechanismen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Laser vangt microdissection (LCM) heeft toegestaan gen expressie analyse van afzonderlijke cellen en cel populaties in weefselsecties verrijkt. LCM is een geweldig hulpmiddel voor de studie van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de celdifferentiatie, de ontwikkeling en de progressie van verschillende ziekten, met inbegrip van glaucoom. Glaucoom, die bestaat uit een familie van progressieve optic neuropathieën, is de meest voorkomende oorzaak van onomkeerbare blindheid wereldwijd. Structurele veranderingen en schade binnen het trabecular gevlochten (TM) kunnen leiden tot verhoogde intraoculaire druk (IOP), dat een belangrijke risicofactor is voor het ontwikkelen van glaucoom. De exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn echter nog steeds slecht begrepen. De mogelijkheid om het gen expressie analyses uit te voeren zullen van cruciaal belang bij het verkrijgen van meer inzicht in de functie van deze cellen en haar rol in de regulatie van de ontwikkeling van het IOP en glaucoom. Om dit te bereiken, verrijkt een reproduceerbare methode voor het isoleren van sterk TM uit bevroren secties van muis ogen en een methode voor de analyse van de expressie van de stroomafwaartse gen, zoals RT-qPCR en RNA-Seq nodig is. De hier beschreven methode is ontwikkeld om zeer zuivere TM van muis ogen isoleren voor downstream digitale PCR en microarray analyse. Deze techniek kunnen bovendien gemakkelijk aan te passen voor de isolatie van andere hoogverrijkt oogbeschadigingen en/of cellen en de cel compartimenten die moeilijk geweest te isoleren van de ogen van de muis. De combinatie van LCM en RNA analyse kan bijdragen tot een vollediger begrip van de cellulaire gebeurtenissen ten grondslag liggen aan de glaucoom.

LCM RNA verkregen in de TM en straalvormig lichaam van 4 verschillende muizen werd geïsoleerd om te kunnen analyseren van genexpressie en de expressie met dat in het hele oog, sclera, iris, netvlies, hoornvlies en lens geïsoleerd uit drie aparte muizen te vergelijken. TM uiting van genen, werden MYOC48 en49 van de ACTA2geanalyseerd in alle verzamelde weefsels te bevestigen dat de geïsoleerde TM monsters inderdaad in TM h...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Hier beschrijven we een protocol voor een reproduceerbare laser vangt microdissection (LCM) voor het isoleren van trabecular gevlochten (TM) voor downstream RNA analyse. De mogelijkheid om het analyseren van wijzigingen in genexpressie in het Vertaalgeheugen zal helpen bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TM-gerelateerde oogbeschadigingen en/of ziekten.

Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bacteriële Gene Expression analyse met behulp van Microarrays

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microdissectie van weefsel van zoogdieren

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...