Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
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국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIEHS 동물 연구 제안 IIDL 05-46에서이 연구의 모든 방법론을 승인 했다.
1. 최적의 조직 컬렉션 레이저 기정에 대 한
<ol><li>2, 3 개월 된 생쥐를 얻을 남성 또는 여성 C57BL/6. 최소 1 분 또는 호흡 정지 했습니다 때까지 CO2 를 안락사. 감 금에서 동물을 제거 하 고 자 궁 경관 탈 구, 잘린, 또는 thoracotomy 죽음을 ...

TM는 중요 한 역할을 적극적으로 유지 하는 항상성 IOP와 그 장애는 널리 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 주요 원인이 되는 요소 하실. GWAS 분석에 의해 확인 된 여러 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 수 증가 녹 내장 위험 및 TM;에서 아 유출 시설에 증가 저항에 연결 된 그러나,이 질병을 정확한 분자 메커니즘은 아?...

녹 내장 질병 광섬유 신경 및 망막 궁극적으로 돌이킬 수 없는 실명1,2리드 특징의 그룹입니다. 2020 이상에 의해 70 백만 명 세계적으로 살게 될 것입니다 질병3,,45,,67의 일종으로 추정 된다. 기본 개방 각 녹 내장 (POAG), 녹 내장, 가장 널리 퍼진 유형의 액 (AH) 유출 증가 안구 내부 압력 (IOP)8,,910, 선도 저하에 의해 특징입니다. 11,12,13,143,15,,1617,18. 왼쪽된 치료, 만성 높은 IOP 망막 및 시 신경 머리 방사형 실명1,2,19를 일으키는 진보적이 고 돌이킬 수 없는 손상으로 이어집니다. Ciliary 바디 아의 생산의 속도 감소 또는 그것의 유출1,,89, 를 강화 하 여 IOP를 감소에 녹 내장의 진행을 둔화에 대 한 모든 현재 메서드 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 주 아 유출 통로 적극적으로 조절에 중요 한 역할을 담당 하는 배수 채널 (TM)의 부적절 한 함수 이며 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 원인이 되는 요소. 그러나, TM 부전와 어떻게 그것은 아 배수 조절 관련 분자 메커니즘 아직 완전히 이해 되지 않는다 며 현재 녹 내장 연구1,2,19, 의 주요 초점 20. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS)는 녹 내장 및 TM에서 아 유출 시설에 증가 저항 유전자의 수를 연결 하 고, 하는 동안 질병으로 이어질 하지 않은 정확한 분자 메커니즘이 아직 완전히 이해21 , 22 , 23 , 24 , 25.
동물 모델 크게3,15,16,26,,2728, (광범위 하 게 검토 하는 녹 내장에 질병 진행의 우리의 현재 지식 향상 29,,3031,,3233). 몇 가지 선구적인 방법은 TM34,,3536 연구 개발 되었습니다 고 정상과 병에 걸리는 직물의 우리의 현재 이해를 사전에 이러한 방법을 널리 사용 되었습니다. 하나의 영역을 광범위 하 게 탐험 되지 않은 TM 실패의 분자 메커니즘 연구를 유전자 변형된 마우스 모델의 사용 이다. 유전자 변형 노크에 Myocilin (Myoc)37,38 등 Cyp1b139, TM 관련 유전자의 녹아웃 마우스 연구 되었습니다 공부 TM의 분자 메커니즘을 위한 기본 도구 기능입니다. 당연 하 게도, 작은 크기의 마우스에서 TM이이 조직 공부를 시작 하기 위하여 극복 되어야 하는 심각한 장애물이 나타냅니다. 마우스 모델 LCM 기술에서 가장 작고 가장 섬세 한 조직, TM 등의 연구 능력을 필요한 도구를 제공 하는 동안 유전학 및 질병의 분자 메커니즘을 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.
이 보고서에는 강력 하 고 재현 방법 후속 RNA 격리 및 다운스트림 식 분석에 대 한 증폭 마우스 눈에서 높은 농축된 TM의 LCM에 대 한 설명 되어 있습니다. 유사한 방법에서에서 사용 된 성공적으로 쥐 눈 조직40,41,42,,4344의 분리, 다른 여기 보고 방법론을 적용할 수 있습니다. RNA, 예측에 관한, DNA, 단백질 공부 하 고 눈의 개별 조직. 중요 한 것은,이 기술은 유전자 변형된 쥐 녹 내장과 눈 질병3,,1516,17 TM 장애의 분자 병 인을 이해를 사용할 수 있습니다. ,18,26,31,,4546. LCM에 의해 마우스 눈의 TM을 능력 추가 여러 눈 질환의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기에 있는 유용한 기술 될 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

레이저 캡처 기정 (LCM)는 단일 세포의 유전자 표정 분석을 허용 하 고 조직 섹션에서 세포 인구를 풍성 하 게. LCM 기본 세포 분화와 개발 및 녹 내장을 포함 하 여 다양 한 질병의 진행 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 훌륭한 도구입니다. 녹 내장, 진보적인 광섬유 neuropathies의 가족 구성, 전세계 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인입니다. 녹 내장을 개발 하기 위한 주요 위험 요소 증가 안구 내부 압력 (IOP), 구조 변경 및 배수 채널 (TM) 내에서 손상 발생할 수 있습니다. 그러나, 관련 된 정확한 분자 메커니즘이 아직도 제대로 이해 하 고. 유전자 표정 분석을 수행 하는 기능 추가 이러한 셀 및 IOP와 녹 내장 개발의 규칙에 있는 그것의 역할의 기능에 대 한 통찰력을 얻기에 중요 한 될 것입니다. 이를 위해, 높은 격리에 대 한 재현 방법 실시간 정량 및 RNA-Seq 필요와 같은 마우스 눈 및 다운스트림 유전자 표정 분석 방법의 냉동된 섹션에서 TM 농축. 여기에 설명 된 메서드는 다운스트림 디지털 PCR 및 microarray 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 TM을 개발 된다. 또한,이 기술은 다른 매우 풍부한 눈 세포 및 마우스 눈에서 분리 하기 어려운 세포 구획의 격리에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. LCM 및 RNA 분석의 조합을 녹 내장 기본 셀룰러 이벤트의 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있다.

LCM TM에서 RNA를 수집 및 4 다른 마우스에서 모양 몸은 유전자 발현을 분석 하 고 비교 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막, 및 렌즈 3 별도 쥐에서 고립에서 그 식 수 절연. TM 유전자 표현, MYOC48 와 ACTA249 격리 TM 샘플 TM에 농축 실제로 높게 했다 확인 모든 수집 된 조직에서 분석 되었다. LCM 샘플에서 cDNA의 매우 낮은 수량에 따라 ...

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Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

연구

생물학

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포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

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