Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care og bruk Committee (ACUC) godkjent alle metoder for denne studien under NIEHS dyr studere forslag IIDL 05-46.
1. optimal vev samling for Laser Microdissection
<ol><li>Få 2 til 3 måneder gammel mus, mann eller kvinne C57BL/6. Euthanize med CO2 i minst 1 min eller til åndedrett har opphørt. Fjern dyret fra buret og sikre død av cervical forvridning, halshogging eller thoracotomy.</li>
	<li>Før disseksjon, k...

TM spiller en viktig rolle i å opprettholde aktivt homøostatisk IOP og dens dysfunksjon er allment akseptert som den viktigste utløsende faktoren for Hypertensiv glaukom1,2,19. En rekke single nukleotid polymorfismer i flere gener identifisert av GWAS analyse har vært knyttet til økt glaukom risiko og økt motstand mot AH strøm anlegg på TM; men er de presise molekylære mekanismene som gir opphav til denne sykdommen enn?...

Grønn stær er en gruppe sykdommer preget av fiberoptisk nevropati og retinopati som til slutt fører til irreversible blindhet1,2. Det er anslått at av 2020 over 70 millioner mennesker over hele verden vil leve med noen form for sykdom3,4,5,6,7. Primære åpen vinkel glaucoma (POAG), den mest utbredte typen glaukom, er preget av en nedgang i aqueous humor (AH) strøm fører til økt intraokulært Press (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Venstre ubehandlet, kronisk opphøyet IOP fører til progressive og irreversibel skade på netthinnen og synsnerven hodet forårsaker radial blindhet1,2,19. Alle gjeldende metoder for å senke progresjonen av glaukom fokuserer på å redusere IOP, enten ved å redusere hastigheten på produksjon av AH av ciliary kroppen eller forbedre sine ut1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekulært meshwork (TM) spiller en viktig rolle i å regulere aktivt primære AH strøm veien og dens feil funksjon er en utløsende faktor for Hypertensiv glaukom1,2,19. Imidlertid molekylære mekanismer knyttet TM dysfunksjon og hvordan å regulere AH drenering er ennå ikke fullt ut forstått og er for tiden av glaukom forskning1,2,19, 20. mens flere genomet hele association studier (GWAS) har koblet en rekke gener til grønn stær og økt motstand mot AH strøm anlegg på TM, nøyaktig molekylære mekanismer som føre til sykdom ikke er ennå fullt ut forstått21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Dyremodeller har kraftig forbedret vår nåværende kunnskap av sykdomsprogresjon i glaukom (mye-omtalt i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flere banebrytende metoder har blitt utviklet for å studere TM34,35,36 , og disse metodene har vært mye brukt til å fremme vår nåværende forståelse av normal og sykt vev. Et område som ikke har utforsket mye er bruk av genmodifiserte musen modeller å studere molekylære mekanismer for TM svikt. Transgene knock-i og banke ut musen studier av TM forbundet gener som Myocilin (Myoc)37,38 og Cyp1b139, er hovedverktøyene du bruker når du studere molekylære mekanismer for TM funksjonen. Forståelig nok, den lille størrelsen på TM i mus representerer et alvorlig hinder som må overvinnes for å begynne å studere dette vevet. Musen modeller representerer et kraftig verktøy for å studere genetikk og molekylære mekanismer av sykdom, mens fremskritt i LCM teknologi gir nødvendig verktøy for å styrke studiet av de minste og mest delikate vev, inkludert TM.
I denne rapporten er en robust og reproduserbar metode beskrevet for LCM av høyanriket TM fra musen øyne med påfølgende RNA isolasjon og forsterkning for nedstrøms uttrykk analyse. Lignende metoder har blitt brukt med hell i mus for å isolere andre typer øye vev40,41,42,43,44, metodikken rapporterte her kan brukes til andre diskret vev i øyet å studere RNA, microRNA, DNA og proteiner. Viktigere, gjør denne teknikken bruk av genmodifiserte mus å forstå molekylær patogenesen av TM svekkelse i grønn stær og okulær sykdom3,15,16,17 ,,18,,26,,31,,45,,46. Muligheten til å isolere TM musen øyne av LCM vil være en nyttig teknikk med å få ytterligere innsikt i molekylære mekanismer av flere øyet sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Laser fange microdissection (LCM) har tillatt gene expression analyse av enkeltceller og beriket celle populasjoner i vev deler. LCM er et flott verktøy for å studere molekylære mekanismer underliggende celledifferensiering og utvikling og progresjon av ulike sykdommer, inkludert glaukom. Grønn stær, som omfatter en rekke progressive fiberoptisk neuropathies, er den vanligste årsaken til irreversible blindhet i verden. Strukturelle endringer og skader innenfor de trabekulært meshwork (TM) kan resultere i økt intraokulært Press (IOP), som er en stor risikofaktor for å utvikle glaukom. Men er de presise molekylære mekanismene involvert fremdeles dårlig forstått. Muligheten til å utføre gene expression analyse vil være avgjørende i å få ytterligere innsikt i funksjon av disse cellene og dens rolle i regulering av IOP og glaukom. For å oppnå dette, beriket en reproduserbar metode for å isolere svært TM fra frosne deler av musen øyne og en metode for nedstrøms gene expression analyse, som RT-qPCR og RNA-Seq. Metoden beskrevet her er utviklet for å isolere svært ren TM fra musen øyne for nedstrøms digital PCR og microarray analyse. Dessuten, kan denne teknikken lett tilpasses for isolering av andre høyt anriket okulær celler og celle rom som er vanskelig å isolere fra musen øyne. Kombinasjonen av LCM og RNA analyse kan bidra til en mer omfattende forståelse av mobilnettet hendelsene underliggende glaukom.

LCM samlet RNA fra TM og ciliary kropp fra 4 forskjellige mus ble isolert for å kunne analysere genuttrykk og sammenligne uttrykket som i hele øyet, sclera, iris, netthinnen, hornhinnen og linsen isolert fra tre separate mus. TM uttrykke genene, ble MYOC48 og ACTA249 analysert i alle innsamlede vev å bekrefte at isolert TM prøvene var faktisk høyanriket i TM. På grunn av ekstremt lavt antall cDNA fra LCM prøvene ble ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Her beskriver vi en reproduserbar laser fange microdissection (LCM) er en protokoll for å isolere trabekulært meshwork (TM) for nedstrøms RNA analyse. Muligheten til å analysere endringer i byggkorn under TM vil hjelpe forstå underliggende molekylære mekanismer av TM-relaterte okulær sykdommer.

Laser fange Microdissection av svært ren trabekulært Meshwork fra musen øyne for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity basert Isolering av Tagged Nuclei fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...