Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Национальный институт экологических медицинских наук (NIEHS) животное уход и использование Комитета (ACUC) одобрил все методологии настоящего исследования под NIEHS животное изучить предложение IIDL 05-46.
1. оптимальное ткани коллекции для лазерной Microdissection
<ol><li>Получить 2-3-месяц?...

ТМ играет жизненно важную роль в поддержании активно гомеостатических ВГД и его дисфункции широко признается основным побудительным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Количество единичных нуклеотидных полиморфизмов в неско?...

Глаукома – это группа заболеваний, характеризуется оптической невропатии и ретинопатии, что в конечном итоге приводит к необратимой слепоте1,2. Предполагается, что к 2020 году более 70 миллионов людей во всем мире будет жить с некоторой формой болезни3,4,5,6,7. Первичной открытоугольной глаукомы (POAG), наиболее распространенным типом глаукомы, характеризуется уменьшением оттока водянистой влаги (AH), приводит к увеличению внутриглазного давления (ВГД)8,9,10, 11,12,,13143,,1516,17,18. Левый untreated, хронически повышенным ВГД приводит к прогрессивной и необратимого повреждения сетчатки и зрительного нерва голову, вызывая радиальные слепота1,2,19. Все текущие методы для замедления прогрессирования глаукомы акцент на снижение ВГД, либо снижения темпов производства Ах, цилиарного тела или повышения его отток1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Трабекулярная сеть (TM) играет жизненно важную роль в активное регулирование основной путь оттока AH, и его неправильная функция является причинным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Однако молекулярные механизмы, связанные с дисфункцией ТМ и как он регулирует дренаж AH еще не полностью изучены и в настоящее время является одним из основных направлений глаукома исследование1,2,19, 20. Хотя несколько генома всей ассоциации исследования (GWAS) связывают ряд генов глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ, точные молекулярные механизмы, которые приводят к болезни не являются полностью осознана21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Животные модели значительно расширили наши текущие знания о прогрессирования заболевания в глаукомы (подробно рассмотрены в3,,1516,26,27,28, 29,-30,-31,-32,-33). Некоторые новаторские методы были разработаны для изучения ТМ34,35,36 , и эти методы широко используются для продвижения нашего нынешнего понимания нормальных и пораженной ткани. Одной из областей, которые не были широко изучены является использование генетически модифицированных мыши модели для изучения молекулярных механизмов ТМ отказа. Трансгенные забивные и нокаут-мыши исследования ТМ связанных генов, например Myocilin (Myoc)37,38 и39 Cyp1b1были основными средствами для изучения молекулярных механизмов ТМ функция. Понятно, что небольшой размер ТМ в мышах представляет серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть для того, чтобы начать учиться этой ткани. Мышь модели представляют собой мощный инструмент для изучения генетики и молекулярных механизмов заболевания, хотя достижения в области технологий LCM предоставляют необходимые инструменты для расширения возможностей исследования маленьких и самых деликатных тканей, включая ТМ.
В настоящем докладе надежных и воспроизводимых метод описан для LCM высокообогащенного ТМ от мыши глаз вместе с последующей РНК изоляции и усилители для анализа течению выражение. Подобные методы были использованы успешно мышей изолировать других типов глаз тканей40,41,42,,4344, методологии, сообщили здесь могут быть применены к другой дискретные тканях глаза для изучения белков, ДНК, РНК и микроРНК. Важно отметить, что этот метод позволяет использовать генетически измененных мышей, чтобы лучше понять молекулярный патогенез ТМ обесценения глаукомы и глазные болезни3,,1516,17 ,18,,2631,45,46. Способность изолировать ТМ мыши глаза LCM будет полезным способом в получении дальнейшее понимание молекулярных механизмов нескольких глазных заболеваний.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Лазерная захвата microdissection (LCM) позволило анализ выражения гена одной клетки и обогатили клеточных популяций в разделах ткани. LCM является отличным инструментом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток и развития и прогрессирования различных заболеваний, в том числе глаукомы. Глаукома, которая включает семейство прогрессивной оптической невропатии, является наиболее распространенной причиной необратимых слепоты во всем мире. Структурные изменения и повреждения в пределах Трабекулярная сеть (TM) может привести к увеличению внутриглазного давления (ВГД), который является основным фактором риска для развития глаукомы. Однако точное молекулярных механизмов все еще плохо поняты. Способность выполнять анализ выражения гена будет иметь решающее значение в получении дальнейшее понимание функции этих клеток и его роль в регуляции ВГД и глаукома развития. Для достижения этой цели, воспроизводимый метод для изоляции высоко обогащенного ТМ от замороженной секции мыши глаза и метод для анализа выражения течению гена, такие как RT-ПЦР и РНК-Seq необходима. Метод, описанный здесь разрабатывается изолировать высоки чисто ТМ от мыши глаз вниз по течению цифровой ПЦР и анализ microarray. Кроме того этот метод может быть легко адаптирована для изоляции других высоко обогащенного глазной клеток и клеточных компартментов, которые было сложно изолировать от мыши глаз. Сочетание анализа LCM и РНК может способствовать более полное понимание сотовой событий, лежащие в основе глаукомы.

LCM собранные РНК от ТМ и цилиарного тела от 4 разных мышей был выделен для того, чтобы иметь возможность анализировать экспрессии генов и сравнить с тем выражение в весь глаз, склера, Ирис, сетчатки, роговицы и объектив изолированы от трех отдельных мышей. ТМ, выражая ген?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Здесь мы описываем протокол для захвата microdissection воспроизводимый лазер (LCM) для изоляции Трабекулярная сеть (TM) для анализа течению РНК. Возможность анализировать изменения в экспрессии генов в НП поможет понять глубинные механизмы глазных заболеваний, связанных с ТМ.

Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Лазерная Захват микродиссекция ткани млекопитающих

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

РНК Изоляция от эмбриональных данио рерио и кДНК синтеза для анализа экспрессии генов

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity основе Выделение Tagged ядер от<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Ткани для анализа экспрессии генов

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...