Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

De nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) djur vård och användning kommittén (ACUC) godkände alla metodiken för denna studie under den NIEHS djur studera förslaget IIDL 05-46.
1. optimala vävnad samling för Laser lokalt
<ol><li>Skaffa 2 till 3 månader gamla möss, manliga eller kvinnliga C57BL/6. Eutanasi med CO2 för minst 1 min eller tills andning har upphört. Ta bort djuret från buren och försäkra döden genom antingen cervikal dislokation, h...

TM spelar en viktig roll i att aktivt bibehålla homeostatiska IOP och dess dysfunktion är allmänt accepterat som den viktigaste orsakande faktorn för hypertensiva glaukom1,2,19. Ett antal enda nukleotid polymorfismer i flera gener identifierats GWAS analys har kopplats till ökad glaukom risk och ökat motstånd mot AH utflöde anläggning vid TM; dock är de exakta molekylära mekanismer som ger upphov till denna sjukdom ä...

Glaukom är en grupp sjukdomar som kännetecknas av optikusneuropati och retinopati som i slutändan leder till irreversibel blindhet1,2. Det uppskattas att av 2020 över 70 miljoner människor världen över kommer att leva med någon form av sjukdom3,4,5,6,7. Primär öppenvinkelglaukom (POAG), den vanligaste typen av glaukom, kännetecknas av en minskning av kammarvatten (AH) utflöde leder till förhöjt intraokulärt tryck (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Vänster obehandlade, kroniskt förhöjt IOP leder till progressiv och oåterkalleliga skador på näthinnan och synnerven huvudet orsakar radiella blindhet1,2,19. Alla nuvarande metoder för att bromsa utvecklingen av glaukom fokus på att minska IOP, antingen genom att minska produktionstakten Ah av ciliarkroppen eller förbättra dess utflöde1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekelverket (TM) spelar en viktig roll i att aktivt reglera den primära AH utflöde vägen och dess felaktig funktion är en orsakande faktor för hypertensiva glaukom1,2,19. Dock de molekylära mekanismer som är associerad med TM dysfunktion och hur det reglerar AH dränering är ännu inte helt förstått och är för närvarande ett stort fokus på glaukom forskning1,2,19, 20. medan flera genome-wide associationsstudier (GWAS) har kopplat ett antal gener till glaukom och ökad motståndskraft mot AH utflöde anläggning vid TM, de exakta molekylära mekanismerna som leder till sjukdom inte är ännu förstått21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Djurmodeller har kraftigt förbättrat vår nuvarande kunskap om sjukdomsprogression vid glaukom (utförligt recenserade i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flera banbrytande metoder har utvecklats för att studera den TM34,35,36 och dessa metoder har använts i stor utsträckning att avancera vår nuvarande förståelse av normala och sjuk vävnad. Ett område som inte har undersökts i stor utsträckning är användningen av genetiskt modifierade musmodeller att studera molekylära mekanismer för TM misslyckande. Transgena inpressning och knock-out mus studier av TM associerade gener, såsom Myocilin (Myoc)37,38 och Cyp1b139, har varit den primära verktygen för att studera molekylära mekanismer för TM funktion. Förståeligt, den lilla storleken på TM i möss representerar ett allvarliga hinder som måste övervinnas för att börja studera denna vävnad. Musmodeller utgör ett kraftfullt verktyg för att studera genetik och molekylära mekanismer av sjukdom, medan framstegen i LCM teknik ger de nödvändiga verktygen för att ge studien av de minsta och mest känsliga vävnader, inklusive TM.
I betänkandet beskrivs en robust och reproducerbar metod för LCM av höganrikat TM från mus ögon tillsammans med efterföljande RNA isolering och förstärkning för nedströms uttryck analys. Liknande metoder har använts framgångsrikt i möss för att isolera andra typer av ögats vävnader40,41,42,43,44, den metod som rapporteras häri kan tillämpas på andra diskreta vävnaderna i ögat att studera RNA, mikroRNA, DNA och proteiner. Viktigast av allt, möjliggör denna teknik användning av genetiskt modifierade möss att bättre förstå de molekylära mekanismer av TM hos glaukom och okulär sjukdom3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Möjligheten att isolera TM mus ögon av LCM blir en användbar teknik att få ytterligare insikter om molekylära mekanismer för flera ögonsjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Laser fånga lokalt (LCM) har tillåtet gen uttryck analys av enstaka celler och berikas cellpopulationer i vävnadssnitt. LCM är ett bra verktyg för studier av molekylära mekanismer bakom celldifferentiering och utveckling och progression av olika sjukdomar, inklusive glaukom. Glaukom, som består av en familj av progressiva fiberoptiska neuropatier, är den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet i världen. Strukturella förändringar och skador inom den trabekulära nätverket (TM) kan resultera i ökat intraokulärt tryck (IOP), som är en stor riskfaktor för att utveckla glaukom. Dock är de exakta molekylära mekanismerna som är inblandade fortfarande bristfällig. Förmågan att utföra gen uttryck analys kommer att vara avgörande att få ytterligare insikter om funktionen av dessa celler och dess roll i regleringen av IOP och glaukom utveckling. För att uppnå detta, berikad en reproducerbar metod för att isolera mycket TM från frusna snitt av mus ögon och en metod för nedströms gen uttryck analys, såsom RT-qPCR och RNA-Seq behövs. Den metod som beskrivs häri är utvecklat för att isolera högt rena TM från mus ögon för nedströms digital PCR och microarray analys. Dessutom, kan denna teknik enkelt anpassas för isolering av andra höganrikat okulär celler och cell fack som har varit svåra att isolera från mus ögon. Kombinationen av LCM och RNA analys kan bidra till en mer omfattande förståelse av de cellulära händelser underliggande glaukom.

LCM samlas RNA från TM och ciliarkroppen från 4 olika möss var isolerad för att kunna analysera genuttryck och jämföra uttrycket med det i hela ögat, sklera, iris, näthinnan, hornhinnan och linsen isolerade från tre separata möss. TM uttrycker gener, analyserades MYOC48 och ACTA249 i alla insamlade vävnader att bekräfta att de isolera TM proverna var verkligen höganrikat i TM. På grund av den extremt låga mä...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Här beskriver vi ett protokoll för en reproducerbar laser fånga lokalt (LCM) för att isolera trabekelverket (TM) för nedströms RNA analys. Förmågan att analysera förändringar i genuttryck i Översättningsminnet hjälp att förstå de bakomliggande molekylära mekanismerna för TM-relaterade ögonsjukdomar.

Laser Capture lokalt av högt rent trabekelverket från mus ögon för gen uttryck analys

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriell Gene Expression Analysis Använda Microarrays

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Microdissection av däggdjur

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infektion &amp; Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infektion &amp; Temporal analys av Virus Gene Expression: Del 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Tillämpat på Gene Expression Profilering av delmängd av celler från Drosophila Wing skiva

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinitetsbaserade Isolering av Tagged Kärnor från<em&gt; Drosophila</em&gt; Vävnader för Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...