Name: laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) NIEHS hayvan çalışma teklifi IIDL 05-46 altında bu çalışmanın tüm metodoloji onayladı.
1. en uygun doku koleksiyonu için lazer mikrodiseksiyon
<ol><li>3-ay-yaşlı fareler, 2'yi edinmek erkek veya kadın C57BL/6. Ötenazi CO2 en az 1 dk ya kadar solunum kesildiği tarih vardır. Kafes hayvan kaldırmak ve servikal yerinden çıkması, işten çıkarma veya torakotomi ölüm si...

TM aktif olarak homeostatik IOP korumada önemli bir rol oynar ve onun disfonksiyon yaygın hipertansif glokom1,2,19ana etken faktör olarak kabul edilir. Tek nükleotid polimorfizmleri çeşitli genlerde GWAS analiz tarafından tanımlanan bir dizi artan Glokom riski ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç bağlantılı olmuştur; Ancak, bu hastalığın ortaya çıkmasına kesin moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anla...

Glokom optik nöropati ve sonuçta geri dönüşü olmayan körlüğü1,2' ye giden retinopati karakterize hastalıklar grubudur. Bu tarafından 2020 over 70 milyon kişi dünya çapında hastalığı3,4,5,6,7çeşit ile yaşıyor olacak tahmin edilmektedir. Birincil açık açılı glokom (POAG), glokom, en yaygın türü göz içi basınç artışı (gib)8,9,10' aönde gelen sulu mizah (AH) çıkış bir azalma ile karakterize, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sol tedavi edilmezse, kronik olarak yükseltilmiş IOP retina ve radyal körlüğü1,2,19neden optik sinir başı ilerici ve geri dönüşü olmayan zarar yol açar. Glokom gib, silier vücut tarafından Ah üretim hızını azaltarak veya bu çıkış1,8,9, artırılması tarafından azaltma konusuna önem ilerlemesini yavaşlatmak için tüm geçerli yöntemleri 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabeküler meshwork (TM) aktif olarak birincil AH çıkım yolu düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve uygunsuz işlevini hipertansif glokom1,2,19için sorumlu bir faktördür. Ancak, TM disfonksiyon ve nasıl AH drenaj düzenleyen ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmış değil ve şu anda önemli bir odak noktası glokom araştırma1,2,19, 20. çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) glokom ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç genleri bir dizi bağladığınız iken hastalığı yol değildir tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak21 anlayamadım , 22 , 23 , 24 , 25.
Hayvan modelleri büyük ölçüde geçerli bilgimizi (3,15,16,26,27,28', kapsamlı bir şekilde gözden glokom hastalığın ilerlemesinde gelişmiş var. 29,30,31,32,33). TM34,35,36 çalışmaya çeşitli öncü yöntemler geliştirilmiştir ve bu yöntemler yaygın olarak normal ve hastalıklı doku geçerli bizim anlayışı ilerletmek için kullanılmıştır. Değil kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır bir alan TM başarısızlık moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak değiştirilmiş fare modellerinin kullanımı olduğunu. Transgenik knock ve knock-out fare çalışmaları gibi Myocilin (Myoc)37,38 ve Cyp1b139, TM ilişkili genlerin TM moleküler mekanizmaları eğitim için birincil araçlar olmuştur işlev. Anlaşılır, farelerde TM küçük boyutlu bu doku çalışmaya başlamak için aşılması gereken ciddi bir engel temsil eder. Fare modelleri LCM teknolojik gelişmeler TM dahil olmak üzere en küçük ve en hassas dokuları çalışma güçlendirmek için gerekli araçları sunarken genetik ve moleküler mekanizmaları hastalık, eğitim için güçlü bir araç temsil eder.
Bu raporda, sonraki RNA izolasyon ve güçlendirme için aşağı akım ifade analizi ile birlikte fare gözlerinden zenginleştirilmiş TM LCM için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi açıklanmıştır. Benzer Yöntem başarıyla farelerde göz dokularının40,41,42,43,44diğer türleri yalıtmak için kullanılmıştır, burada bildirilen metodoloji diğerine uygulanabilir RNA, mikroRNA, DNA ve proteinler çalışmaya göz ayrı dokuların. Önemlisi, bu teknik TM bozukluğu glokom ve oküler hastalığı3,15,16,17 moleküler patogenezi daha iyi anlamak için genetik olarak değiştirilmiş fare kullanımı sağlar ,18,26,31,45,46. Yeteneğini LCM fare gözlerle TM izole etmek-ecek var olmak daha fazla birkaç oküler hastalıkların moleküler mekanizmaları anlayışlar elde yararlı bir yöntem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) gen ifade analizi tek hücre izin ve hücre popülasyonlarının doku bölümlerde zenginleştirilmiş. LCM hücre farklılaşma ve geliştirme ve glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesini temel moleküler mekanizmaları incelenmesi için harika bir araçtır. Glokom, ilerici optik neuropathies bir ailenin oluşur, geri dönüşü olmayan körlüğü dünya çapında en sık nedenidir. Yapısal değişiklikler ve trabeküler meshwork (TM) içinde hasar glokom geliştirmek için önemli bir risk faktörü olan göz içi basınç artışı (gib), neden olabilir. Ancak, hassas moleküler mekanizmaları dahil hala kötü anlaşılır. Gen ifade analizi gerçekleştirme olanağı daha fazla bu hücreler ve rolünü IOP ve glokom gelişme Yönetmelikte işlevi anlayışlar elde etmek çok önemli olacak. Bunu başarmak için RT-qPCR ve RNA-Seq gereklidir gibi son derece izole bir tekrarlanabilir Yöntem TM fare gözler ve bir yöntemi için aşağı akım gen ifade analizi, donmuş bölümlerden zenginleştirilmiş. Burada açıklanan yöntemi son derece saf TM fare gözlerinden aşağı akım dijital PCR ve Mikroarray analiz için izole etmek için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, bu Teknik yalıtım diğer zenginleştirilmiş oküler hücreleri ve fare gözlerinden izole etmek zordu hücre bölmeleri için kolayca adapte edilebilir. LCM ve RNA Analizi kombinasyonu glokom temel hücresel olaylar daha kapsamlı bir anlayış için katkıda bulunabilir.

LCM RNA TM toplanan ve 4 farklı fareler vücuttan silier gen ekspresyonu analiz ve bu ifadeyle bütün göz, sklera, Iris, retina, kornea ve objektif üç ayrı fare izole karşılaştırmak için izole edildi. TM, genlerin ifade izole TM örnekleri gerçekten son derece TM zenginleştirilmiş onaylamak için toplanan tüm dokularda MYOC48 ve ACTA249 analiz edildi. CDNA LCM örneklerinden son derece düşük miktar nedeniy...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...