Name: a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

Dit werk werd financieel ondersteund door de R & D plannen van Guangdong Province (PR China) (2016A050503028).

Alle procedures met inbegrip van menselijk bloed collectie werden goedgekeurd door de zon Yat-Sen Universiteit ethische commissie.
1. GPC3-S-Fab Design strategie
<ol><li>GPC3-S-Fab ontwerpen door het koppelen van een Fab van anti-GPC3 (gehumaniseerd GC3313) met een anti-CD16 VHH14 (Figuur 1).</li>
	<li>Synthetiseren en kloon van de VH-CH1-CD16-VHH en VL-CL in de vectoren pET26b en pET21a als eerder gemeld<sup class...

<ol>
	<li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs.">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).</li><li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment.">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li><li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics,+antibody+engineering,+and+the+merits+of+protein+stability.">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li><li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies:+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles.">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li><li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+interactions+in+the+Fab+fragment:+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability.">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li><li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors.">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications.">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).</li><li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention,+Detection,+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases.">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bispecific+antibody,+S-Fab,+induces+potent+cancer+cell+killing.">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells.">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32 (2016).</li><li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells.">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li><li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+(CD16)+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells.">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li><li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+single-domain+antibodies+in+bacterial+systems.">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li><li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression+of+antibodies.">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li><li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies.">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li><li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans:+proteoglycans+with+a+surprise.">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li><li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic,+preneoplastic,+and+neoplastic+tissues:+a+tissue+microarray+analysis+of+4,387+tissue+samples.">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li><li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis.">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders.">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li><li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

In deze studie, presenteren wij een strategie voor de bouw van een nieuwe indeling van bsAbs, GPC3-S-Fab, die NK cellen gericht op GPC3 positieve tumorcellen kan aanwerven. De S-Fab is gebaseerd op de natuurlijke Fab formaat door toevoeging van een anti-CD16 VHH11,12. Vergeleken met de bsAbs met Fc regio, kan GPC3-S-Fab gemakkelijk worden geproduceerd in het periplasma van bacteriën op grote schaal.
Met behulp van de strategie van het...

Monoclonal antilichamen zijn nu over het algemeen gebruikt voor kanker behandeling1. Als gevolg van de flexibiliteit van antilichamen, werden diverse antilichaam gebaseerde formaten actief onderzocht. Vergeleken met monoklonale antilichamen, hebben bsAbs twee verschillende antigeen-bindende modules, waardoor ze te herkennen met twee verschillende doelen tegelijk en efficiënt leiden tot de aanwerving van immuun effector cellen te richten en te doden van tumor cellen2.
Huidige recombinante bsAb formaten kunnen over het algemeen worden toegewezen aan twee klassen: Fc-bevattende bsAbs en bsAbs zonder een Fc-regio. Vergeleken met Fc-bevattende indelingen die worden meestal geproduceerd in zoogdiercellen, bsAbs zonder een Fc-regio hebben de voordelen van kleinere, meer gemakkelijk in expressiesystemen micro-organisme worden geproduceerd, en tumor weefsels efficiënter kan doordringen 3.
bsAbs zonder een Fc-regio worden vaak gevormd door individuele bindend wordt, zoals één-keten variabele fragmenten (scFvs) of Fabs3te koppelen. Zonder de stabiliserende domeinen, bsAbs op basis van scFv fragmenten vaak geknoeid thermische stabiliteit, lage oplosbaarheid of een toegenomen potentieel voor aggregatie4,5. Fab gebaseerde bsAbs zijn daarentegen meer stabiel als gevolg van de heterodimerization van de CH1 en CL in de inheemse Fab deel4,6.
Variabele domein van zware-keten-only-antilichamen (VHHs, ook wel aangeduid als één domein antilichamen) zijn de actieve antigeen-bindende fragment van natuurlijke zware-keten antilichamen7. VHHs hebben de kenmerken van hoge affiniteit, specificiteit van conventionele IgGs8, lage immunogeniciteit en hoge opbrengst in bacteriële expressie9. Vergeleken met de Fv fragmenten, hebben VHHs hogere thermische stabiliteit10. Vergeleken met Fab wordt, hebben VHHs kleinere maten als gevolg van het ontbreken van CH1 en CL. S-Fab, de bsAb formaat, verkregen door het koppelen van de Fab met een enkel domein antilichamen, VHH, is zo ontworpen en studeerde voor zijn anti-tumor effecten11,12.
In deze studie werd de bouw van GPC3-S-Fab door het koppelen van de Fab van hGC3313 met een anti-CD16a VHH14 beschreven. De GPC3-S-Fab kan efficiënt worden geproduceerd door periplasmische expressie in Escherichia coli (E. coli). Functionele studies van GPC3-S-Fab suggereerde dat GPC3-S-Fab een veelbelovende strategie voor leverkanker therapie is. Dus, de voordelen van GPC3-S-Fab over alternatieve technieken met toepassing verwijzingen naar eerdere studies zijn gemakkelijk productie en zuivering, en meer stabiele bsAbs.
Zoogdieren expressiesystemen en prokaryote expressiesystemen zijn gebruikt om verschillende formaten van BsAbs express. In tegenstelling tot zoogdieren expressiesystemen, E. coli-gebaseerde eiwit expressiesystemen hebben vele voordelen, waaronder hoge opbrengsten, lage kosten en arbeidsbesparende, het gemak van genetische manipulaties, en hoge transformatie efficiëntie15. Voor bsAbs expressie in E. coli, zijn er twee fundamentele strategieën: expressie in het cytoplasma en expressie in het periplasma tussen het cytoplasma en buitenste celmembraan15. Vergeleken met de vermindering omgeving van cytoplasma, is het periplasma een meer oxiderende milieu, dat de juiste vouwen stimuleert en co uitdrukking van eiwitten16. Juiste vouwen speelt een belangrijke rol in de generatie van de oplosbaarheid, stabiliteit en functie van bsAbs. Daarom is een signaal reeks pelB toegevoegd aan de N-terminus van de S-Fab naar directe secretie om het periplasma van E. coli17. Om ervoor te zorgen werkzaam correct vouwing, oplosbaarheid, thermische stabiliteit en conformationele stabiliteit, vermindering van de complexiteit en de omvang van een antilichaam is vaak16. De S-Fab-indeling bestaat uit een Fab en één VHH, die zeer goed wordt uitgedrukt in bacteriële systemen waarschijnlijk te wijten aan de eenvoudige structuur en kleine omvang.
GPC3 werd in dit GPC3-S-Fab bispecifieke antilichaam formaat gekozen. Glypican-3 (GPC3) is een lid van de heparine sulfaat (HS) Proteoglycaan familie die wordt verankerd aan het celoppervlak via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 is overexpressie in 70% van de gevallen van hepatocellulaire carcinoom (HCC), die goed zijn voor de meerderheid van de lever kanker19,20,21,22. Omdat GPC3 zelden in normale weefsels uitgedrukt is, GPC3 voorgesteld als een potentieel doelwit voor HCC. Meerdere muis mAbs zijn geproduceerd tegen GPC3. Echter alleen GC33 tentoongesteld beperkte anti-tumor activiteit 22en zij nagelaten om klinische werkzaamheid bij patiënten tentoon te stellen. In deze studie GPC3-S-Fab bleek te kunnen werven van NK-cellen te doden GPC3 tumor cellen14.
Werven van NK-cellen, werd anti-CD16 VHH gebruikt. CD16a is een lage affiniteit IgG receptor, uitgedrukt voornamelijk op natural killer (NK) cellen, monocyten en macrofagen en enkele subtypen van T-cellen. Het is betrokken bij de cytotoxiciteit (ADCC) van de antilichaam-afhankelijke cel van NK cellen23. Menselijke NK cellen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten, CD56 - CD16 + en CD56 + CD16-. In tegenstelling tot CD56 + CD16− NK-cellen, CD56-CD16 + NK-cellen kunnen vrijgeven van hogere niveaus van Perforine en granzyme B en aldus een sterke cytotoxiciteit24. Kupffer cellen (KCs), uiting van CD16a, zijn de ingezetene macrofagen in de lever. Kupffer cellen spelen een belangrijke rol bij de onderdrukking van leverkanker25. Dus, is bsAbs gericht op CD16a mogelijk een meer belovende strategie dan boeiende T cellen tegen leverkanker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

Dit protocol beschrijft de bouw en functionele studies van een bispecifieke antilichaam (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs herkent twee verschillende epitopen door hun twee verschillende wapens. bsAbs zijn actief bestudeerd om hun vermogen om direct werven immune cellen te doden tumorcellen. Op dit moment worden de meeste bsAbs geproduceerd in de vorm van recombinante eiwitten, hetzij als bsAbs Fc-bevattende hetzij als kleinere bsAb derivaten zonder de Fc-regio. In deze studie werd GPC3-S-Fab, een antilichaam fragment (Fab) gebaseerde bispecifieke antilichaam, ontworpen door de Fab van anti-GPC3 antistof GC33 met een anti-CD16 één domein antilichaam te koppelen. De GPC3-S-Fab kan worden uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd door twee affiniteit chromatographies. Het gezuiverde GPC3-S-Fab kan specifiek binden aan en GPC3 positieve lever kankercellen doden door de indienstneming van natural killer cellen, hetgeen wijst op een mogelijke toepassing van GPC3-S-Fab in therapie leverkanker.

GPC3-S-Fab zuivering
GPC3-S-Fab was gezuiverd van E. coli door een tweestaps affiniteit zuivering, eerst met Ni-NTA-agarose, gevolgd door IgG-CH1 affiniteit zuivering. Na de zuivering van de affiniteit in twee stappen, was GPC3-S-Fab gezuiverd tot homogeniteit met de twee kettingen dicht bij 1:1 (figuur 2A). De aanwezigheid van zowel VH-CH1-CD16 VHH en VL-CL polypeptiden ka...

Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Hier presenteren we een protocol om te produceren een antilichaam bispecifieke GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Het gezuiverde GPC3-S-Fab heeft krachtige cytotoxiciteit tegen GPC3 positieve lever kankercellen.

Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...