Name: a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela R & D plano da província de Guangdong (China PR) (2016A050503028).

Todos os procedimentos, incluindo a coleta de sangue humano foram aprovados pelo Comitê de ética Sun Yat-Sen University.
1. GPC3-S-Fab Design Estratégia
<ol><li>Projeto GPC3-S-Fab, vinculando um Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) com um anti-CD16 VHH14 (Figura 1).</li>
	<li>Sintetizar e clonar o CH1-VHH-CD16-VH e VL-CL em vetores pET26b e pET21a, como relatado anteriormente,12.</li>
</o...

<ol>
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Neste estudo, apresentamos uma estratégia para construir um novo formato de bsAbs, GPC3-S-Fab, que pode recrutar células NK como alvo as células de tumor positivo GPC3. O S-Fab baseia-se a Fab natural formato adicionando um anti-CD16 VHH11,12. Comparado com a região de Fc contendo bsAbs, GPC3-S-Fab pode ser facilmente produzida no periplasm de bactérias em grande escala.
Usando a estratégia de expressão e purificação descrita ...

Os anticorpos monoclonais são agora amplamente utilizados para tratamento de câncer1. Devido à flexibilidade dos anticorpos, vários formatos baseados em anticorpos têm sido ativamente explorados. Comparado com anticorpos monoclonais, bsAbs ter dois módulos de ligação diferente do antígeno, permitindo-lhes a reconhecer dois alvos diferentes simultaneamente e de forma eficiente acionar o recrutamento de células imunes efetoras para alvejar e matar células de tumor2.
Formatos de recombinantes bsAb atual podem ser geralmente atribuídos a duas classes: Fc-contendo bsAbs e bsAbs sem uma região de Fc. Comparado com formatos Fc-contendo principalmente produzidos em células de mamíferos, bsAbs sem uma região Fc tem as vantagens de tamanhos menores, mais facilmente são produzidos em sistemas de expressão de microorganismo e podem penetrar em tecidos de tumor mais eficientemente 3.
bsAbs sem uma região de Fc são formados comumente vinculando metades de vinculação individual, como fragmentos de variável de cadeia única (scFvs) ou Fabs3. Sem os domínios de estabilização, bsAbs com base em fragmentos scFv frequentemente ter comprometido a estabilidade térmica, baixa solubilidade ou um aumento potencial de agregação de4,5. Em contraste, bsAbs baseada na Fab são mais estáveis devido a heterodimerization do CH1 e CL no nativo moiety Fab4,6.
Domínio variável da cadeia pesada-somente anticorpos (VHHs, também conhecidos como anticorpos único domínio) são o ativo fragmento de antígeno-ligando da cadeia pesada natural anticorpos7. VHHs tem as características de alta afinidade, especificidade de convencional IgGs8, baixa imunogenicidade e rendimentos elevados em expressão bacteriana9. Comparado com fragmentos de Fv, VHHs ter maior estabilidade térmica10. Comparado com Fab metades, VHHs têm tamanhos menores devido à falta de CH1 e CL. Assim, S-Fab, o formato de bsAb obtido, vinculando o Fab com um anticorpo de domínio único, VHH, foi concebido e estudado por seus efeitos anti-tumorais11,12.
Neste estudo, foi descrita a construção de GPC3-S-Fab, vinculando o Fab de hGC3313 com um anti-CD16a VHH14 . O GPC3-S-Fab pode ser eficientemente produzido por periplasmático expressão em Escherichia coli (e. coli). Estudos funcionais de GPC3-S-Fab sugeriram que GPC3-S-Fab é uma estratégia promissora para a terapia do câncer de fígado. Assim, as vantagens do GPC3-S-Fab em técnicas alternativas com referências aplicáveis aos estudos anteriores incluem fácil produção e purificação e bsAbs mais estável.
Sistemas de expressão de mamíferos e expressão procarióticas têm sido utilizadas para expressar vários formatos de BsAbs. Em contraste com sistemas de expressão dos mamíferos, e. coli-sistemas de expressão de proteínas com base tem muitos benefícios, incluindo rendimentos elevados, baixo custos e labor-saving, a facilidade de manipulações genéticas e transformação de alta eficiência15. Para bsAbs expressão em e. coli, existem duas estratégias básicas: expressão no citoplasma e expressão no periplasm entre o citoplasma e membranas externas de célula15. Em comparação com o ambiente redutor do citoplasma, o periplasm é um oxidante mais ambiente, que promove o dobramento correto e co expressão de proteínas16. Dobramento correto desempenha um papel fundamental na geração de solubilidade, estabilidade e função de bsAbs. Portanto, um sinal sequência pelB foi adicionado para o N-terminal do Fab-S para dirigir a secreção para o periplasm de Escherichia coli17. Para garantir a correta de dobramento, solubilidade, estabilidade térmica e estabilidade conformacional, reduzindo a complexidade e o tamanho de um anticorpo é frequentemente empregado16. O formato S-Fab consiste de um fabuloso e um VHH, que se expressa muito bem em sistemas bacterianos prováveis devido à estrutura simples e pequeno tamanho.
GPC3 foi escolhido neste formato de anticorpo bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) é um membro da família de proteoglicano de sulfato (HS) heparina que é ancorado à superfície da célula através de de glicosilfostidilinosiol (GPI)18. GPC3 é Blumental em 70% dos casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representam a maioria dos cânceres de fígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente é expressa em tecidos normais, GPC3 tem sido proposto como um alvo potencial para HCC. Múltiplos do mouse mAbs foram produzidos contra GPC3. No entanto, apenas GC33 exibiu limitada atividade anti-tumoral 22, e que não apresentam eficácia clínica em pacientes. Neste estudo, GPC3-S-Fab foi mostrado para ser capaz de recrutar células NK para matar de células de tumor GPC314.
Para recrutar células NK, anti-CD16 VHH foi usado. CD16a é um receptor de IgG de baixa afinidade, expressado principalmente em células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e alguns subtipos de células T. Está envolvido na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por NK células23. Células NK humanas podem ser classificadas em dois tipos, CD56 - CD16 + e CD56 + CD16-. Em contraste com as células NK CD56 + CD16−, CD56-células CD16 + NK podem liberar os níveis mais elevados de perforina e granzime B e, portanto, apresentar uma forte citotoxicidade24. Células de Kupffer (KCs), expressando a CD16a, são os macrófagos residentes no fígado. Células de Kupffer desempenham um papel importante na supressão de câncer de fígado,25. Assim, bsAbs segmentação CD16a pode ser uma estratégia mais promissora do que enfrentar as células T contra câncer de fígado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

Este protocolo descreve a construção e estudos funcionais de um anticorpo bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs pode reconhecer dois diferentes epitopos através de suas duas armas diferentes. bsAbs têm sido estudados ativamente por sua capacidade de recrutar diretamente as células imunes para matar células tumorais. Atualmente, a maioria dos bsAbs é produzida na forma de proteínas recombinantes, quer como bsAbs Fc-contendo derivados de bsAb menores sem região Fc. Neste estudo, GPC3-S-Fab, um anticorpo de bispecific com base de anticorpo fragmento (Fab), foi projetado, vinculando o Fab do anticorpo anti-GPC3 GC33 com anticorpos anti-CD16 único domínio. O GPC3-S-Fab pode ser expressa em Escherichia coli e purificado por duas cromatografias de afinidade. O purificado GPC3-S-Fab especificamente pode vincular a e matar células de câncer de fígado positivo GPC3 através do recrutamento de células de assassinas naturais, sugerindo uma potencial aplicação de GPC3-S-Fab na terapia do câncer de fígado.

Purificação de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab foi purificado de e. coli por uma purificação da afinidade em duas etapas, primeiro com Ni-NTA-agarose, seguido de purificação de IgG-CH1 afinidade. Após a purificação da afinidade em duas fases, GPC3-S-Fab foi purificado a homogeneidade com as duas correntes perto de 1:1 (Figura 2A). A presença de polipeptídeos tanto VHH CD16...

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A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um anticorpo bispecific GPC3-S-Fab em Escherichia coli. O GPC3-S-Fab purificado tem potente citotoxicidade contra células de câncer de fígado positivo GPC3.

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Pesquisa do câncer

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...