Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (U1503223، 81673407، 21475131)، تطبيق مشروع البحث المتعلق بالتكنولوجيا غير ربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016 ج 37110)، نينغبوه الدولي للعلم والتكنولوجيا مشروع التعاون (10019 د 2014)، فريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015 ج 110026)، علوم نينغبو & مشروع التكنولوجيا للثروة المشتركة (ج 2017 50042)، مجموع داك لي ييب صندوق التنمية الصيدلانية البيولوجية البحرية كينيث لي تشين ييو والصندوق ك جيم وونغ ماجنا في نينغبو جامعة.

1-حل إعداد
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لمصادر كاشف.
<ol><li>تعد حلاً ألبومين مصل بقرى 5% (BSA) عن طريق إضافة 5 غ من جيش صرب البوسنة إلى 100 مل الماء المقطر مزدوجة. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.</li>
	<li>تعد حلاً A11 oligomer المضا...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

في هذا البروتوكول، أبلغنا طريقة لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ، وتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-الإيجابية بنقطة النشاف تحليل. على الرغم من أن لدينا أساليب لإعداد العينات الغنية أوليجومير1-42 Aβ بسيط جداً، ويمكن الاعتماد عليها، واستنساخه، لا تزال هناك بعض النق...

مرض الزهايمر (ميلادي) واحد من أهم الأمراض الأعصاب التي تؤثر على كبار السن في جميع أنحاء العالم1. من المقبول على نطاق واسع أن التجميع غير طبيعي من بيتا-اميلويد (Aβ) قد يكون العامل المرضية الرائدة للإعلان. Aβ المجاميع هي المكونات الرئيسية من لويحات خرف، واحدة من علامات بيولوجية في أدمغة المرضى الإعلانية. وعلاوة على ذلك، تنتج المجاميع Aβ، بما في ذلك ليغومرات على وجه الخصوص، السمية العصبية القوية، التي قد يكون سبب الوفاة العصبية كما تقدم الإعلانية. ولذلك، قد منع تثبيط تشكيل oligomer Aβ نيوروديجينيريشن، ويمكن وضع مثبطات oligomer Aβ كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. واستخدمت العديد من الدراسات ببتيد Aβ اصطناعية لتشكل ليغومرات في المختبر، واستكشاف مورفولوجيس وهياكل اصطناعية Aβ ليغومرات، والتحقيق مثبطات oligomer Aβ تستخدم في المختبر نماذج2،3 , 4-ولكن مختلفة في المختبر تكوين بروتوكولات Aβ oligomer يمكن أن يؤدي إلى أوليجومير مع الخصائص المورفولوجية المختلفة، مما قد يؤدي إلى نتائج لا تضاهي بين المجموعات البحثية المختلفة. ولذلك، ثمة حاجة ملحة بروتوكول تكوين قياسي ل Aβ oligomer.
حتى الآن، أبلغ عن أساليب كثيرة غير مباشرة الكشف عن ليغومرات Aβ. مجهر إلكتروني (TEM) غير يشوه التفريد جل والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ودوت النشاف التحليل يمكن استخدامها لدراسة كمية و/أو مورفولوجية Aβ oligomer في المختبر5، 6. على سبيل المثال، يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا وهيكل Aβ oligomer في TEM. ويمكن قياس الكميات النسبية والحجم الجزيئي لتجميعات Aβ بالتفريد جل غير يشوه. أليسا يمكن استخدامها لتحديد oligomer Aβ في المصل والبلازما، ومقتطفات من أنسجة المخ. وأخيراً، دوت النشاف التحليل، تقنية تستخدم للكشف عن، تحليل وتحديد البروتينات، يمكن استخدامها لتقييم تركيز نسبي oligomer Aβ في عينات مختلفة مع المساعدة من الأجسام المضادة أوليجومير و Aβ محددة. وعلاوة على ذلك، يوفر نقطة النشاف المقايسة قدرا كبيرا من الوقت وفورات، التفريد جل وإجراءات بلوتينج للمواد الهلامية غير مطلوبة. ولذلك، يستخدم هذا الفحص عادة مثبطات oligomer Aβ المحتملة في الشاشة. والهدف العام من هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا وموثوق بها، واستنساخه لإعداد نموذج غنية أوليجومير1-42 Aβ، لتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ دوت النشاف التحليل، وعلى الشاشة Aβ oligomer مثبطات استخدام النتائج التجريبية شبه كمي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

اميلويد بيتا (Aβ) ببتيد مسعور مع اتجاه جوهرية لتجميع ذاتي في المجاميع. بين مجاميع مختلفة، Aβ oligomer مقبول على نطاق واسع عصبي الرائدة في التقدم لمرض الزهايمر (AD) ويعتبر أن الحدث الحاسم في الآلية المرضية للإعلان. ولذلك، قد منع نيوروديجينيريشن مثبطات oligomer Aβ ويمكن أن توضع كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. ومع ذلك، تشكيل مختلف بروتوكولات Aβ oligomer قد تؤدي إلى ليغومرات ذات خصائص مختلفة. وعلاوة على ذلك، لا توجد العديد من الطرق لفعالية الشاشة Aβ1-42 مثبطات أوليجومير. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية أوليجومير1-42 Aβ السمية مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية إعداد نموذج Aβ A11-إيجابية غنية أوليجومير1-42 من اصطناعية Aβ1-42 ببتيد في المختبر وتقييم كميات نسبية من أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية في عينات من النشاف دوت تحليل استخدام A11 و Aβ1-42-الأجسام المضادة 6E10 محددة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أيضا فحص مثبطات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية من النتائج التجريبية شبه كمي.

للتحقيق في ما إذا كان مونومر1-42 Aβ يمكن أن تشكل أوليجومير1-42 Aβ بعد إعداد، تم استخدام تحليل ال. لا تظهر المجاميع لوحظت في العينة مونومر Aβ حل هفيب1-42 (الشكل 1أ). وعلاوة على ذلك، أساسا كروي المجاميع التي يبلغ قطرها حوالي 10-80 نانومتر وقد...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد ليغومرات Aβ من ببتيد اصطناعية في المختبر وتقييم الكميات النسبية من Aβ oligomer بنقطة النشاف التحليل.

إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA وCLC: Downregulation CLF-1-تعتمد من CNTFRα كما تظاهر عن طريق ويسترن التنشيف، تثبيط إنزيمات الليزوزومية، وسيتولوجية مناعية

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

إعداد العينة والكمية النسبية باستخدام الميثيل الاختزالي للأمينات لدراسات علم البيبتي

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...