Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), il progetto di ricerca applicata su tecnologia senza scopo di lucro della provincia del Zhejiang (2016C 37110), Ningbo internazionale di scienza e tecnologia Progetto di cooperazione (2014D 10019), Ningbo comunale Innovation Team del Life Science e salute (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech progetto per ricchezza comune (2017C 50042), il Li Dak somma Yip Yio mento Kenneth Li Marine biofarmaceutica Development Fund, e del fondo di K. C. Wong Magna a Ningbo University.

1. soluzione preparazione
Nota: Vedere Tabella materiali per le origini di reagente.
<ol><li>Preparare una soluzione di 5% albumina di siero bovino (BSA) con l'aggiunta di 5 g di BSA per 100 mL di acqua bidistillata. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.</li>
	<li>Preparare una soluzione di A11 dell'anticorpo anti-oligomero (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione di BSA al 5%. Mescola...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

In questo protocollo, abbiamo segnalato un metodo per preparare campioni contenenti oligomero Aβ1-42 e per analizzare la quantità di oligomero di A11-positivi Aβ1-42 da un punto di analisi macchiante. Anche se i nostri metodi per la preparazione di campioni Aβ1-42 oligomero-ricchi sono abbastanza semplici, affidabili e riproducibili, ci sono ancora alcuni punti per essere notato. In primo luogo, HFIP viene utilizzato per sciogliere sintetico peptide Aβ1-42 . Un aggregato p...

Morbo di Alzheimer (annuncio) è una delle più importanti malattie neurodegenerative che colpisce le persone anziane nel mondo1. È ampiamente accettato che l'aggregazione anormale di β-amiloide (Aβ) può essere il fattore patologico principale dell'annuncio. Aggregati Aβ sono i componenti principali delle placche senili, uno dei marcatori biologici nei cervelli dei pazienti dell'annuncio. Inoltre, gli aggregati Aβ, oligomeri in particolare, producono neurotossicità potente, che potrebbe essere la causa della morte di un neurone come progredisce AD. Di conseguenza, l'inibizione della formazione di oligomeri Aβ potrebbe impedire la neurodegenerazione e inibitori oligomero Aβ potrebbero essere sviluppati come modificante la malattia trattamenti dell'annuncio. Molti studi hanno utilizzato un peptide Aβ sintetico per formare oligomeri in vitro, esplorare morfologie e strutture degli oligomeri Aβ artificiali e indagare gli inibitori dell'oligomero Aβ utilizzando in vitro modelli2,3 , 4. Tuttavia, protocolli di formazione diversi in vitro dell'oligomero Aβ potrebbero portare a oligomero con differenti caratteristiche morfologiche, che potrebbe causare i risultati incomparabili tra diversi gruppi di ricerca. Di conseguenza, un protocollo di formazione standard per oligomero Aβ è urgentemente necessaria.
Fino ad ora, non ci sono molti metodi sono stati segnalati per rilevare direttamente oligomeri Aβ. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM), gel elettroforesi non-denaturante, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e dot blotting analisi può essere utilizzati per esaminare la quantità e/o la morfologia di Aβ oligomero in vitro5, 6. ad esempio, la morfologia e la struttura dell'oligomero Aβ può essere osservati nel TEM. La quantità relativa e dimensioni molecolari delle aggregazioni di Aβ può essere misurate mediante elettroforesi non-denaturante. ELISA potrebbe essere utilizzata per determinare oligomero Aβ in siero, plasma ed estratti dal tessuto cerebrale. Infine, dot blotting analisi, una tecnica utilizzata per la rilevazione, analisi e identificazione di proteine, potrebbe essere utilizzato per valutare la concentrazione relativa di oligomero Aβ in diversi campioni con l'aiuto di anticorpi Aβ-specifiche e oligomero. Inoltre, un dot blotting analisi offre notevole risparmio di tempo, come l'elettroforesi del gel e le procedure macchiante per gel non sono necessari. Pertanto, questa analisi è usata normalmente per potenziali inibitori di oligomero Aβ di schermo. L'obiettivo generale del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice, affidabile e riproducibile per preparare un campione Aβ1-42 oligomero-ricco, di analizzare la quantità di oligomero Aβ1-42 da dot blotting analisi e oligomero Aβ schermo inibitori utilizzando semi-quantitativa di risultati sperimentali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-amiloide (Aβ) è un peptide idrofobo con un'intrinseca tendenza ad auto-assemblarsi in aggregati. Tra i vari aggregati, oligomero Aβ è ampiamente accettata come la neurotossina leader nel progresso della malattia di Alzheimer (AD) ed è considerato l'evento cruciale nella patogenesi dell'annuncio. Di conseguenza, Aβ oligomero inibitori potrebbero impedire la neurodegenerazione e hanno il potenziale per essere sviluppato come modificante la malattia trattamenti dell'annuncio. Tuttavia, i protocolli di diversa formazione di oligomeri Aβ potrebbero portare a oligomeri con caratteristiche diverse. Inoltre, non ci sono molti metodi per efficacemente gli inibitori di oligomero del1-42 di schermo Aβ. Un anticorpo A11 può reagire con un sottoinsieme di tossico oligomero di Aβ1-42 con strutture di β-foglio anti-parallelo. In questo protocollo, si descrive come preparare un campione di oligomero-ricco A11-positivi Aβ1-42 da un sintetico Aβ1-42 del peptide in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero di1-42 di Aβ A11-positivi in campioni tamponando un puntino analisi usando A11 e Aβ1-42-6E10 specifici anticorpi. Usando questo protocollo, inibitori dell'oligomero di A11-positivi Aβ1-42 possono essere selezionati anche da risultati sperimentali semi-quantitativa.

Per studiare se un monomero Aβ1-42 può formare un oligomero Aβ1-42 dopo la preparazione, analisi TEM è stata usata. Non aggregati visibili sono stati osservati nel campione HFIP-dissolta Aβ1-42 monomero (Figura 1A). Inoltre, principalmente globulari aggregati con un diametro di circa 10-80 nm sono stati osservati nel campione Aβ1-42 dopo 48 h di agitazione, suggerendo che Aβ1-42 fo...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA e CLC: Downregulation CLF-1-dipendente di CNTFRα come dimostrato dalla Western Blotting, inibizione di enzimi lisosomiali, e Immunocitochimica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Ricerca

Biochimica

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparazione del campione e quantificazione relativa mediante metilazione riduttiva delle ammine per studi peptidomici

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...