Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (U1503223, 81673407, 21475131), 비영리 기술의 강성 (2016 C 37110), 닝 보 국제 과학 및 기술에 적용 하는 연구 프로젝트에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 협력 프로젝트 (2014 D 10019), 생명 과학 및 의료 (2015 C 110026)의 닝 보 시 혁신 팀, 닝 보 과학 및 일반적인 부 (2017 C 50042)에 대 한 기술 프로젝트, 리 투 합 입 어 턱 케네스 리 해양 의약품 개발 기금, 그리고 닝 보 대학에서 K. C. 웡 마그나 기금.

1. 솔루션 준비
주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.
<ol><li>이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	<li>5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

이 프로토콜에서 우리 Aβ1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집...

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계1에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 , 그러나 4., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상 특성을 가진 올리고 머를 발생할 수 있습니다. 따라서, Aβ 올리고 머에 대 한 표준 형성 프로토콜 절실히 필요 합니다.
지금까지 많은 방법은 직접 검색 Aβ 올리고 보고 되었습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 및 점 분석 blotting 사용할 수 있습니다 금액 또는 Aβ 올리고 머 생체 외에서5, 의 형태를 검사 하 6. 예를 들어 Aβ 올리고 머의 구조와 형태 TEM에서 관찰 될 수 있다. Aβ 집계의 분자 크기 및 상대 금액 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법에 의해 측정 될 수 있는. ELISA 혈 청, 플라스마, 및 뇌 조직에서 추출 물에서 Aβ 올리고 머를 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로, 분석, 검색, 사용 되는 기술 blotting 점 분석 및 단백질, 식별 사용할 수 올리고 머 및 Aβ 관련 항 체의 도움으로 다른 샘플 올리고 머 Aβ의 상대 농도 평가 하. 또한, 분석 결과 더 럽 히는 점이 젤 전기 이동 법 및 젤에 대 한 더 럽 히 절차 필요 하지 않습니다 상당한 시간 절약을 제공 합니다. 따라서,이 분석 결과 화면 잠재적인 Aβ 올리고 머 억제제를 일반적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 분석, blotting 점으로 화면 Aβ 올리고 머를 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플 준비 하 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현성 메서드를 설명 하는 억제제 반 정량적 실험 결과 사용 하 여입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

Aβ1-42 단위체 준비 후 Aβ1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ1-42 준비 (<strong class=...

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A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

연구

생화학

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...