Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (U1503223, 81673407, 21475131), prosjektet brukes på Nonprofit teknologien for provinsen Zhejiang (2016C 37110), Ningbo International vitenskap og teknologi Samarbeid Project (2014D 10019), Ningbo kommunale innovasjon Team liv og helse (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech-prosjektet for vanlige rikdom (2017C 50042), Li Dak summen Yip Yio Chin Kenneth Li Marine biofarmasøytisk Development Fund, og K. C. Wong Magna fondet ved Ningbo University.

1. løsning forberedelse
Merk: Se Tabell for materiale for reagens kilder.
<ol><li>Forbered en 5% bovin serum albumin (BSA) løsning ved å legge til 5 g av BSA 100 mL dobbel-destillert vann. Bland dem helt av vortexing dem. Lagre løsningen på 4 ° C i opptil 1 måned.</li>
	<li>Forberede en anti-oligomer antistoff A11 løsning (1:1, 000) ved å legge 10 µL av antistoff lagerløsning 10 mL av 5% BSA løsningen. Bland dem helt av vortexing dem. Lagre løsningen på 4 ° C ...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

I denne protokollen, har vi rapportert en metode å forberede prøver som inneholder Aβ1-42 oligomer og analysere mengder A11-positive Aβ1-42 oligomer ved en prikk blotting analyse. Selv om våre metoder for utarbeidelsen av Aβ1-42 oligomer-rik prøver er ganske enkel, pålitelig og reproduserbare, er det fortsatt noen poeng legges merke til. For det første HFIP til å oppløse den syntetiske Aβ1-42 peptid. En oppsamlet Aβ1-42 peptid kan Demonter til monomer i ...

Alzheimers sykdom (AD) er en av de viktigste nevrodegenerative sykdommene som påvirker eldre mennesker over hele verden1. Det er allment akseptert at unormal aggregering av β-amyloid (Aβ) kan være den ledende patologiske faktoren av Annonsen. Aβ aggregater er hovedkomponentene i senil plaketter, en av de biologiske markørene i hjernen til AD pasienter. Videre produsere Aβ aggregat, inkludert oligomers spesielt potente nevrotoksisitet, som kan være årsaken til nevronale død som AD pågår. Derfor hemming av Aβ oligomer formasjon kan hindre neurodegeneration og Aβ oligomer hemmere kunne utvikles som sykdom-modifisere behandlinger av Annonsen. Mange studier har brukt et syntetisk Aβ peptid å danne oligomers i vitro, utforske morphologies og strukturer i kunstig Aβ oligomers og undersøke hemmere av Aβ oligomer bruker i vitro modeller2,3 , 4. imidlertid forskjellige i vitro formasjon protokoller av Aβ oligomer kan føre til oligomer med forskjellige morfologiske kjennetegn, som kan føre til de uforlignelige resultatene blant forskjellige forskningsgrupper. Derfor, en standard formasjon protokoll for Aβ oligomer er haster.
Inntil nå har ikke mange metoder blitt rapportert å oppdage direkte Aβ oligomers. Overføring elektronisk mikroskopi (TEM), ikke-denaturing gel geleelektroforese, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) og dot blotting analyse kan brukes til å undersøke beløp og/eller morfologi av Aβ oligomer i vitro5, 6. For eksempel morfologi og strukturen i Aβ oligomer kan observeres i TEM. De relative mengdene og molekylær størrelse av Aβ samlinger kan måles ved ikke-denaturing gel geleelektroforese. ELISA kan brukes til å fastslå Aβ oligomer i serum, plasma og utdrag fra hjernevev. Til slutt, dot blotting analyse, en teknikk som brukes for å oppdage, analysere og identifisere proteiner, kan brukes til å evaluere den relative konsentrasjonen av Aβ oligomer i forskjellige prøver med hjelp av oligomer-spesifikk og Aβ-spesifikke antistoffer. Videre gir en prikk blotting analysen vesentlige tidsbesparelser, gel gelelektroforese og gels blotting prosedyrer ikke er nødvendig. Derfor denne analysen er vanligvis brukt til skjermen potensielle Aβ oligomer hemmere. Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive en relativt enkel, pålitelig og reproduserbar metode for å forberede en Aβ1-42 oligomer-rik prøve, å analysere mengder Aβ1-42 oligomer av dot blotting analyse og skjermen Aβ oligomer hemmere bruker semi kvantitative eksperimentelle resultater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-amyloid (Aβ) er en hydrofobe peptid med en iboende tendens til å selv sette sammen til aggregatene. Blant ulike aggregatene, Aβ oligomer er allment akseptert som den ledende neurotoxin i utviklingen av Alzheimers sykdom (AD) og anses å være den avgjørende hendelsen i patogenesen av Annonsen. Derfor Aβ oligomer hemmere kan forhindre neurodegeneration og har potensial til å bli utviklet som sykdomsmodifiserende behandling av Annonsen. Imidlertid kan forskjellige formasjon protokoller av Aβ oligomer føre til oligomers med ulike egenskaper. Videre er det ikke mange metoder for å effektivt skjermen Aβ1-42 oligomer hemmere. Et A11 antistoff kan reagere med et delsett av giftige Aβ1-42 oligomer med anti-parallell β arks strukturer. I denne protokollen beskriver vi hvordan å forberede et A11-positive Aβ1-42 oligomer-rike utvalg av en syntetisk Aβ1-42 peptid i vitro og evaluere relativ mengder A11-positive Aβ1-42 oligomer i prøver av en prikk blotting analyse bruker A11 og Aβ1-42-spesifikke 6E10 antistoffer. Bruker denne protokollen, kan hemmere av A11-positive Aβ1-42 oligomer også bli vist fra semi kvantitative eksperimentelle resultater.

For å undersøke om en Aβ1-42 monomer kan danne en Aβ1-42 oligomer etter forberedelse, ble TEM analyse brukt. Ingen synlige oppsamlinger ble observert i HFIP-oppløst Aβ1-42 monomer utvalget (figur 1A). Videre hovedsakelig globular aggregater med en diameter på rundt 10-80 nm ble observert i Aβ1-42 utvalget etter 48 timer med risting, antyder at Aβ1-42 danner oligomers etter forber...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Denne protokollen beskriver hvordan å forberede Aβ oligomers fra en syntetisk peptid i vitro og å vurdere relativ mengder Aβ oligomer ved en prikk blotting analyse.

A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjelp av Dot Blotting analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα som demonstrert ved Western Blotting, Hemming av lysosomale enzymer, og Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse metode for High-throughput identifisering av proteiner samspill med et kjernefysisk kofaktor Bruke LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En Tailored HPLC rensing protokoll som gir høy renhet amyloid beta 42 og amyloid beta 40 peptider, i stand til oligomerdannelsen

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Prøvepreparering og relativ kvantrasjon ved bruk av reduktiv metylering av aminer for peptidomikkstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Studie av funksjonene og aktivitetene til Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 ved bruk av Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...