Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (U1503223, 81673407, 21475131), o projeto de pesquisa aplicada na tecnologia sem fins lucrativos de Zhejiang província (2016C 37110), Ningbo Internacional de ciência e tecnologia Projecto de cooperação (2014D 10019), a equipe de inovação Municipal de Ningbo da ciência da vida e saúde (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech projeto riqueza comum 2017C 50042, Li Dak soma Yip Chin Yio Kenneth Li Marine biofarmacêutica fundo de desenvolvimento, e o fundo de K. C. Wong Magna na Universidade de Ningbo.

1. preparação da solução
Nota: Consulte a Tabela de materiais para fontes de reagente.
<ol><li>Prepare uma solução de 5% albumina de soro bovino (BSA) pela adição de 5 g de BSA para 100 mL de água bidestilada. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês.</li>
	<li>Prepare uma solução de A11 de anticorpo antioligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo para 10 mL da solução de 5% de BSA. Mis...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

Neste protocolo, registramos um método para preparar amostras contendo oligómero Aβ1-42 e analisar as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo por um ponto de análise a mancha. Embora nossos métodos para a preparação de amostras de ricos oligómero Aβ1-42 são bastante simples, confiáveis e reprodutíveis, existem ainda alguns pontos para ser notado. Em primeiro lugar, HFIP é usado para dissolver o péptido sintético de1-42 de Aβ. Um peptídeo de1-4...

A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais importantes que afetam as pessoas idosas no mundo1. É amplamente aceito que a agregação anormal de β-amiloide (Aβ) pode ser o principal factor patológico do anúncio. Aβ agregados são os principais componentes das placas senis, dentre os marcadores biológicos nos cérebros de pacientes. Além disso, agregados Aβ, nomeadamente oligómeros, produzem neurotoxicidade potente, que pode ser a causa da morte neuronal no decorrer AD. Portanto, a inibição da formação de oligómero Aβ pode impedir a neurodegeneração e inibidores Aβ oligómero poderiam ser desenvolvidos como doença-modificando tratamentos de AD. Muitos estudos têm usado um peptídeo sintético de Aβ para formar oligômeros em vitro, explorar morfologias e estruturas de oligômeros Aβ artificiais e investigar os inibidores do oligómero Aβ usando em vitro modelos2,3 , 4. no entanto, diferentes em vitro protocolos de formação do oligómero Aβ podem levar a oligómero com diferentes características morfológicas, o que pode causar os resultados incomparáveis entre grupos de pesquisa diferentes. Portanto, um protocolo de formação standard para oligómero Aβ é urgentemente necessária.
Até agora, não há muitos métodos têm sido relatados para detectar diretamente oligómeros Aβ. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), não-desnaturação electroforese do gel, ensaio imunoenzimático (ELISA) e ponto de análise a mancha podem ser usados para examinar a quantidade e/ou morfologia de Aβ oligómero 5, 6. por exemplo, a morfologia e estrutura do oligómero Aβ podem ser observados na temperatura. Os montantes relativos e tamanho molecular de agregações de Aβ poderiam ser medidos pela electroforese do gel não-desnaturação. ELISA poderia ser usada para determinar oligómero Aβ em soro, plasma e excertos do tecido cerebral. Por último, ponto de análise, uma técnica utilizada para a detecção, a mancha analisando e identificando as proteínas, poderia ser usado para avaliar a concentração relativa de oligómero Aβ nas diferentes amostras com a ajuda do oligómero-Aβ específicas e de anticorpos. Além disso, um ponto do ensaio de mancha oferece economia de tempo significativo, como a electroforese do gel e os mancha procedimentos para géis não são necessários. Portanto, este ensaio é normalmente usada para tela potenciais Aβ oligómero inibidores da. O objetivo geral do presente protocolo é para descrever um método relativamente simples, confiável e reprodutível para preparar uma amostra da rica oligómero Aβ1-42 , para analisar as quantidades de oligómero Aβ1-42 por ponto de análise a mancha e para oligómero Aβ tela usando os resultados experimentais semi-quantitativa de inibidores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-amiloide (Aβ) é um peptídeo hidrofóbico com uma tendência intrínseca de auto-montagem em agregados. Entre vários agregados, oligómero Aβ é amplamente aceita como a neurotoxina principal no progresso da doença de Alzheimer (AD) e é considerado o evento crucial na patogênese da AD. Portanto, inibidores de oligómero Aβ podem impedir a neurodegeneração e têm o potencial para ser desenvolvido como doença-modificando tratamentos de AD. No entanto, protocolos de formação diferente do oligómero Aβ podem levar a oligômeros com características diferentes. Além disso, não existem muitos métodos para efetivamente tela Aβ1-42 oligómero inibidores. Um anticorpo A11 pode reagir com um subconjunto de tóxico oligómero de1-42 de Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Neste protocolo, descrevemos como preparar uma amostra de oligómero ricos A11-positivo Aβ1-42 de um sintético Aβ1-42 peptídeo em vitro e avaliar quantidades relativas de oligómero de1-42 Aβ A11-positivo em amostras por uma mancha do ponto análise usando A11 e Aβ1-42-anticorpos específicos 6E10. Usando este protocolo, inibidores de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo podem também projectados de semi-quantitativa de resultados experimentais.

Para investigar se um monômero de1-42 de Aβ pode formar um oligómero de1-42 de Aβ após preparação, utilizou-se análise de temperatura. Não agregados visíveis foram observados na amostra de monômero de1-42 de Aβ HFIP-dissolvido (Figura 1A). Além disso, principalmente globulares agregados com um diâmetro de ao redor 10-80 nm foram observados na amostra1-42 Aβ após 48 h de tremer, suger...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA e CLC: Downregulation CLF-1 dependente de CNTFRa como demonstrado por Western Blotting, inibição da Lisossomal Enzimas e Imunocitoquï¿½ica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Bioquímica

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Estudo das Funções e Atividades do Co-Transportador Neuronal K-Cl KCC2 Usando Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...