Name: a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (U1503223, 81673407, 21475131), forskningsprojektet tillämpas på ideell teknik i Zhejiangprovinsen (2016C 37110), Ningbo International vetenskap och teknik Samarbetsprojekt (2014D 10019), Ningbo kommunala Innovation Team av Life Science och hälsa (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech projekt för Common Wealth (2017C 50042), Li Dak summan Yip Yio hakan Kenneth Li Marine biofarmaceutiska utvecklingsfonden, och K. C. Wong Magna fonden vid Ningbo universitet.

1. lösningen förberedelse
Obs: Se Tabell av material för reagens källor.
<ol><li>Bered en 5% bovint serumalbumin (BSA) genom att lägga till 5 g av BSA 100 mL dubbeldestillerat vatten. Blanda dem helt av vortexa dem. Förvara lösningen vid 4 ° C i upp till 1 månad.</li>
	<li>Bered en anti oligomer antikropp A11 (1:1, 000) genom att lägga till 10 µL av antikropp stamlösning till 10 mL av 5% BSA lösningen. Blanda dem helt av vortexa dem. Förvara lösningen vid 4 °...

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

I detta protokoll, har vi rapporterat en metod att förbereda prover som innehåller Aβ1-42 oligomer och analysera mängder A11-positiv Aβ1-42 oligomerer av en prick blotting analys. Även om våra metoder för beredning av Aβ1-42 oligomer-rika prover är ganska enkla, tillförlitliga och reproducerbara, finns det fortfarande några punkter att märkas. För det första används Bovallstrand att upplösa den syntetiska Aβ1-42 peptiden. En aggregerad Aβ1-42 pepti...

Alzheimers sjukdom (AD) är en av de viktigaste neurodegenerativa sjukdomar som drabbar äldre människor världen över1. Det är allmänt accepterat att onormala sammanläggning av β-amyloid (Aβ) kan vara den ledande patologiska faktorn av AD. Aβ-aggregat är huvudkomponenterna i senila plack, en av de biologiska markörerna i hjärnan hos AD-patienter. Dessutom producerar Aβ aggregat, inklusive oligomerer särskilt potent neurotoxicitet, som kan vara den neuronala dödsorsaken som AD fortskrider. Därför hämning av Aβ oligomer bildandet kan förebygga neurodegeneration och Aβ oligomer hämmare skulle kunna utvecklas som sjukdomsmodifierande behandlingar av AD. Många studier har använt en syntetisk Aβ-peptid för att bilda oligomerer i vitro, utforska morfologier och strukturer av konstgjorda Aβ oligomerer och undersöka hämmare av Aβ oligomer med in vitro- modeller2,3 , 4. dock olika in vitro- bildandet protokoll av Aβ oligomer kan leda till oligomer med olika morfologiska kännetecken, som kan orsaka de ojämförliga resultat bland olika forskargrupper. Därför är ett standard bildandet protokoll för Aβ oligomer brådskande.
Tills nu, har inte många metoder rapporterats att direkt detektera Aβ oligomerer. Överföring elektronisk microscopy (TEM), icke-denatureringen gelelektrofores, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) och dot blotting analys kan användas för att undersöka de belopp och/eller morfologi av Aβ oligomer in vitro-5, 6. exempel på Morfologi och struktur av Aβ oligomer kan observeras i TEM. Den relativa belopp och molekylär storlek av Aβ aggregeringar kunde mätas med icke-denatureringen gelelektrofores. ELISA kunde användas för att bestämma Aβ oligomer i serum, plasma och extrakt från hjärnvävnaden. Slutligen kunde dot blotting analys, en teknik som används för att upptäcka, analysera och identifiera proteiner, användas för att utvärdera den relativa koncentrationen av Aβ oligomer i olika prover med hjälp av oligomer-specifika och Aβ-specifika antikroppar. Dessutom erbjuder en prick blotting assay betydande tidsvinst, gelelektrofores och blotting förfarandena för geler inte krävs. Denna analys används därför normalt att skärmen potentiella Aβ oligomer inhibitorer. Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva en relativt enkla, tillförlitliga och reproducerbara metod för att förbereda en Aβ1-42 oligomer-rika prov, att analysera belopp av Aβ1-42 oligomer dot blotting analys och att skärmen Aβ oligomer -hämmare med semikvantitativ experimentella resultat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td>
			<td style="width:219px;">Abcam</td>
			<td style="width:211px;">GR91739-58</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td>
			<td>Cell&#160;Signalling Technology</td>
			<td>2454S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">A&#946;1-42</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>52487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>I1523078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin Bovine V</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D920BA0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30166428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#215;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genshare CFAS anyKD PAGE</td>
			<td>Genshare</td>
			<td>JC-PE022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>T50189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10014118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super low range&#160;protein Marker</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>PR1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer Membranes</td>
			<td>Immobilon-PSQ</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeyoECL Star</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Commassie Blue Fast staining solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All - automatic chemiluminescence imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>Tanon 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic agitator</td>
			<td>Shanghai Huxi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-amyloid (Aβ) är en hydrofoba peptid med en inneboende tendens att själv montera i aggregat. Bland olika aggregat, Aβ oligomer är allmänt accepterat som den ledande nervgift i utvecklingen av Alzheimers sjukdom (AD) och anses vara den avgörande händelsen i patogenesen av AD. Därför Aβ oligomer hämmare kan förhindra neurodegeneration och har potential att utvecklas som sjukdomsmodifierande behandlingar av AD. Olika bildandet protokoll av Aβ oligomer kan dock leda till oligomerer med olika egenskaper. Dessutom finns det inte många metoder för att effektivt skärmen Aβ1-42 oligomer-hämmare. En A11 antikropp kan reagera med en delmängd av giftiga Aβ1-42 oligomer med anti parallell β-ark strukturer. I detta protokoll beskriver vi hur att förbereda en A11-positiv Aβ1-42 oligomer-rika prov från en syntetisk Aβ1-42 peptid i vitro och utvärdera relativa belopp för A11-positiv Aβ1-42 oligomer i prover av en dot blotting analys med A11 och Aβ1-42-specifika 6E10 antikroppar. Användning av detta protokoll, kan hämmare av A11-positiv Aβ1-42 oligomer också undersökas från semikvantitativt experimentella resultat.

För att undersöka huruvida en Aβ1-42 monomer kan bilda en Aβ1-42 oligomer efter beredning, användes TEM analys. Inga synliga aggregat observerades i Bovallstrand-upplöst Aβ1-42 monomer provet (figur 1A). Dessutom främst klotformiga aggregat med en diameter på runt 10-80 nm observerades i Aβ1-42 provet efter 48 h av skakningar, vilket tyder på att Aβ1-42 bildar oligomerer efter...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive ÃŽÂ²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Det här protokollet beskriver hur att förbereda Aβ oligomerer från en syntetisk peptid i vitro och utvärdera relativa mängder av Aβ oligomerer av en prick blotting analys.

A11-positiv β-amyloid oligomerer beredning och bedömning med hjälp av Dot Blotting analys

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA och CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa som framgår av Western blotting, Hämning av lysosomala enzymer och Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Ett protein framställningsmetod för hög kapacitet Identifiering av proteiner interagerar med en kärnteknisk Cofactor Använda LC-MS / MS-analys

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet Amyloid Beta 42 och Amyloid Beta 40 Peptider som kan oligomerbildning

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Provberedning och relativ mängd med reduktiv metylering av aminer för peptidomikstudier

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Studie av funktioner och aktiviteter av neuronala K-Cl Co-Transporter KCC2 med hjälp av Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...