Name: whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries at JoVE.com

ونحن نشكر ريبيكا وليامز وجوانا ديلا كروز من "تصوير BRC كورنيل" وأندرو ريكناجيل للاقتراحات المفيدة والمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل إلى المعاهد الوطنية للصحة منحة S10-OD018516 ("مرفق" كورنيل للتصوير)، و T32HD057854 إلى J.C.B. و R01-GM45415 إلى J.C.S.

جامعة كورنيل "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) وافق جميع الأساليب الموصوفة هنا، تحت بروتوكول عام 2004-0038 لهيئة الأركان المشتركة.
1-إعداد الصكوك وثقافة وسائل الإعلام
<ol><li>مسح منطقة عمل نظيفة مع التبييض 10% والسماح التبييض تبقى على سطح منطقة العمل لمدة 5 دقائق على الأ...

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sampling+on+the+reproducibility+of+ovarian+follicle+counts+in+mouse+toxicity+studies.">Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies.</a> Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).</li><li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Generated+Ovaries+to+Assist+Follicle+Counting+Experiments.">Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).</li><li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole-Mount+Approach+for+Accurate+Quantitative+and+Spatial+Assessment+of+Fetal+Oocyte+Dynamics+in+Mice.">A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis.">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10 (2011).</li><li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

ويتطلب دراسة استنساخ الثدييات استخدام والتحديد الكمي للخلايا المتخصصة غير قابلة بشكل روتيني لزراعة الخلايا. السابقين فيفو ثقافة أنظمة غير فعالة في الحفاظ على المبيض والمسام صلاحية1،15. خلال الثقافة المبيض، الأنسجة يتطلب مساحة أكبر لتبادل المواد الغذ?...

من أجل دراسة تكوين الخلوية والسمات المورفولوجية المبايض الثدييات، العلماء غالباً ما تعتمد على التجارب في فيفو متبوعاً بتلوين إيمونوهيستولوجيكال المبايض البارافين المضمنة. أكثر مؤخرا رغم ذلك، ثقافة الجهاز المبيض كله قد ثبت أن بديل فعال لدراسة وظيفة المبيض1،2،،من34 لأن هذه التقنية يمكن أن يقترن بالتصور أفضل و أدوات القياس الكمي. تقليديا، تحليلاً مورفولوجيا المبيض يعتمد على إعادة بناء هيكل المبيض ثلاثي الأبعاد من مقاطع المسلسل البارافين مضمن، ولكن، بالإضافة إلى كونها شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، متسلسل تقطيع الأنسجة البارافين مضمن لا ضمان إعادة البناء السليم للجهاز، وكثيراً ما فقدت أقسام أو أمر بسوء في العملية.
بالإضافة إلى التحديات التقنية المرتبطة بتقطيع المسلسل، وهناك أيضا اختلافات في الأساليب المستخدمة بشكل روتيني لتقدير أرقام جريب كل المبيض5،6. تباين المنهجية المستخدمة حاليا ويضعف التحليل التلوي لاحتياطي المبيض عبر الدراسات5،7. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف أرقام جريب من المقالات والبحوث المختلفة بالوقت أو أكثر بين الإعمار إنمائية مماثلة ضمن سلالة معينة6. هذه الاختلافات الكبيرة في التحديد الكمي جريب المبلغ عنها يمكن أن يؤدي إلى الارتباك وعرقلت إجراء مقارنات عبر الدراسة. تجريبيا، يؤديها النهج التقليدية لتحديد مقدار جريب من مقاطع المسلسل العد المسام عدد محدد سلفا من المقاطع (مثلاً كل الخامسة، العاشرة، أو قسم آخر). ينشأ تقلب في تهم المسام باستخدام هذا النهج ليس فقط من التواتر في المقاطع التي يتم عدها، بل أيضا من الاختلافات في سمك الفرع، والخبرة التقنية في توليد مقاطع المسلسل5،6. بالإضافة إلى قابليته، عيب آخر لتقطيع الأنسجة التقليدية أن تقطيع المبايض صغيرة من صغار الحيوانات تنطوي على تحديات خاصة وتعتمد اعتماداً كبيرا على اتجاه الأنسجة8.
البروتوكول أدناه يصف أسلوب1 ثقافة مبيض تستخدم بشكل روتيني ولكن يحسن إلى حد كبير على التقدير الكمي جريب التقليدية عن طريق استبدال تمزيقها المادية مع أنسجة تطهير وتمزيقها الضوئية باستخدام مجهر [كنفوكل]8 ،9. مسح استخدام الغمر الأنسجة (بدون الحاجة لنضح transcranial أو التفريد) في اليوريا والسوربيتول-يستند إلى نظام الحل (مثلاً، ScaleS(0)10) ثبت متوافق مع إيمونوستينينج ويسمح للحد من مسح وقت دون المساس بعمق للتصوير. أساليب أخرى تم الإبلاغ عنها (مثلاً، ScaleA2،من810، سيدب11، كليارت12و ClearT212) أما أكثر تستغرق وقتاً طويلاً أو عدم السماح بالدقة البصرية متعمقة للعينة. تقطيع الضوئية مفيد لأنه أقل كثيفة العمالة ويحتفظ الجهاز هيكل ثلاثي الأبعاد7،8. فائدة أخرى من هذا النهج هو أن إعداد العينات التي لا تتطلب الكواشف باهظة التكلفة لإزالة الأنسجة، ويمكن أن تجري بسهولة نسبية.
على وجه التحديد، البروتوكول وصف قد الأمثل المبايض الماوس المستزرعة في يوم الولادة خمسة لكن أجريت على المبايض بدءاً من يوم الولادة 0-10. الأسلوب يجعل استخدام نظام الثقافة المبيض الذي تولي الأنسجة بالطبع للغشاء الذي كان هو مثقف، تسهيل التعامل مع الجهاز والتلاعب. يمكن استخدام نظام الثقافة ووصف للحفاظ على اكسبلانتيد المبايض لمدة تصل إلى 10 أيام وتقييم ظروف تجريبية مختلفة كيف قد تتداخل مع بقاء البويضات13. تتم باستخدام الصورة غير التجارية تجهيز الحزمة فيجي-إيماجيج14 إجراء التقدير الكمي ووصف ويمكن أن تجري في معظم أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة على ذلك، الصور المستخدمة للقياس الكمي يمكن أن يتاح على نطاق واسع للمجتمع العلمي، مما يسمح للتحليل التلوي مستقبلا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Micro dissecting scissor 4.5&#34;, straight, sharp points</td>
			<td style="width:200px;">Roboz</td>
			<td style="width:117px;">RS-5912</td>
			<td style="width:224px;">Micro dissecting scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jewelers style forceps 4-3/8&#34;, style 5</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Fine tip forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Iris Scissors 4&#34;, straight, sharp points</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-1618</td>
			<td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Minimal Essential Media (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Used in Step 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm Tissue Culture Treated Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nunc&#8482; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>141006</td>
			<td>Pore size: 8&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutator mixer GyroTwister&#8482;</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S1000-A-B</td>
			<td>three dimensional shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103219-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride solution (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl Alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>Cold water soluble</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM 163A</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-MVH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td>Dilution 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-mouse 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-rabbit 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(-)sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240850-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI-ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414044-034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

البحوث في مجال البيولوجيا الإنجابية الثدييات غالباً ما ينطوي على تقييم الصحة العامة المبايض والخصيتين. على وجه التحديد، في الإناث، وغالباً ما يتم تقييم اللياقة البدنية المبيض بتصور والتحديد الكمي للمسام وبويضات. نظراً لأن المبيض أنسجة ثلاثية الأبعاد معتمة، النهج التقليدية تتطلب مشقة تشريح الأنسجة إلى مقاطع المسلسل العديد من أجل تصور خلايا في جميع أنحاء الجهاز كامل. وعلاوة على ذلك، لأنه عادة ما يستتبع القياس الكمي بهذا الأسلوب سجل مجموعة فرعية فقط من أقسام مفصولة بقطر تقريبي البويضات، عرضه لعدم دقتها. هنا، هو وصف بروتوكول يستخدم بدلاً من ذلك إزالة الأنسجة الجهاز كله وتلطيخ الفلورة من المبايض الماوس وضع تصور للمسام وبويضات. ومقارنة بالأساليب التقليدية، هذا البروتوكول مفيد لتصور خلايا داخل المبيض لأسباب عديدة: 1) المبيض لا تزال سليمة في جميع أنحاء عينة التحضير والتجهيز؛ 2) يمكن فحص المبايض صغيرة، وصعبة للقسم، بسهولة؛ 3) يتحقق القياس الكمي الخلوية أكثر سهولة ودقة؛ و 4) الجهاز كله تصويرها.

يتضمن هذا البروتوكول 6 خطوات رئيسية بعد تشريح المبيض، كما هو مبين في الشكل 1. الشكل 2 , الشكل 3 , الشكل 4 إبراز السمات الأكثر رواية لهذا البروتوكول، التي تشمل الاستفادة المثلى أنسج...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries at JoVE.com

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد حجم المسام في المبيضين مثقف للفئران الصغار دون تقطيع المسلسل. استخدام الجهاز كاملة الفلورة والأنسجة المقاصة، تمزيقها المادية يتم استبداله بتقطيع الضوئية. هذا الأسلوب من إعداد العينة والتصور يحافظ على سلامة الجهاز ويسهل الآلي التقدير الكمي للخلايا المحددة.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

The overall goal of this procedure is to obtain images of cultured whole ovaries that are compatible with automated follicle quantification. This method can help answer key questions in the reproductive biology field such as how different conditions interfere with ovarian fitness. The main advantage of this technique is that it is less labor intensive and maintains the organ's three-dimensional architecture.Though this method has been optimized for cultured mouse ovaries at postnatal day five, it can also be applied to other ages and tissues such as embryonic gonads or young mice testes. Start with a clean work surface. Wipe with ten percent bleach and allow the bleach to remain on the work area surface for at least five minutes.After five minutes, remove excess bleach with clean paper towels and 70 percent ethanol. Clean the dissecting microscope thoroughly with 70 percent ethanol and place a dry paper towel on the stage. Wrap clean forceps and scissors with a paper towel dampened with 70 percent ethanol.Then make 50 milliliters of ovary culture media in a conical tube and warm in a 37 degrees Celsius water bath. After the medium has warmed, prepare plates and inserts by first adding one milliliter of ovary culture medium to 35 millimeter tissue culture plates. Then add approximately 0.55 milliliters of medium to the wells of a 24-well tissue culture plate and place an insert into each well containing medium.Make sure that the membranes touch the media. Place the 35 millimeter plates and the 24-well carrier plate into a 37 degrees Celsius, five percent carbon dioxide and atmospheric oxygen incubator. Then place a hot plate next to the dissection scope and set the temperature to 37 degrees Celsius.If the tissue culture incubator is not close to the dissection area, place one of the 35 millimeter tissue culture dishes containing ovary culture media on the hot plate. Then begin the dissection by spraying the freshly euthanized female with 70 percent ethanol and place on top of the dry paper towel under the dissection microscope. After making an incision in the abdominal cavity, extrude the intestines and locate the ovaries.Extract the ovaries and place them into the culture medium in the 35 millimeter dish. Once the ovaries have been dissected, increase the magnification of the dissection microscope to better visualize ovaries and any attached tissue. With clean fine tip forceps, remove all non-ovarian tissue such as bursa and fatty tissue without damaging the ovaries.Next, place each pair of ovaries onto a pre-soaked cell culture insert and adjust the volume of the medium to ensure that it is sufficient to keep the organ moist without completely submerging it. Place explanted organs in a 37 degrees Celsius, five percent carbon dioxide and atmospheric oxygen incubator. At the desired experimental time point, remove the ovary culture media from the plate and fix the cultured ovaries on the insert by covering the tissue with freshly prepared four percent PFA solution.Seal the edges of the plate with paraffin film to avoid evaporation and place the samples at four degrees Celsius overnight. Rinse the tissue three times with 70 percent ethanol. Then store in scintillation vials filled with 70 percent ethanol at four degrees Celsius until further processing.Begin staining by removing the 70 percent ethanol from the vials and washing the fixed tissue with PBS at room temperature with shaking for a minimum of four hours. After removing the PBS, add enough permeabilization solution to completely submerge the ovaries. Place on an orbital shaker and incubate at room temperature for four hours.Replace the permeabilization solution with enough blocking solution to completely submerge the ovaries. Then incubate the sealed vials at room temperature for a minimum of 12 hours on an orbital shaker. After blocking, place the inserts into a 24-well plate and add about 750 microliters of primary antibody solution ensuring that ovaries are completely submerged.Then place the sealed plate on the orbital shaker and incubate for four days at room temperature. After four days, remove the primary antibody and add a generous amount of washing solution. Wash the ovaries overnight.The next day, replace with fresh washing solution and incubate on the orbital shaker for two hours or more. After the washes, add secondary antibody solution. Protect the samples from light and incubate on an orbital shaker at room temperature for two days.After two days, remove the secondary antibody solution from the samples and add washing solution. Begin by preparing ScaleS0 clearing solution. Mix the solution by inversion and incubate at 50 degrees Celsius for 30 minutes.De-gas the ScaleS0 clearing solution. Then remove the washing solution from the immunostained ovaries. Add the clearing solution.Cover the plate with aluminum foil and return it to the orbital shaker. It is extremely important to be patient during the staining and clearing steps. Once the tissue has become transparent, use a fine tip scalpel to carefully remove the insert membranes containing the cultured ovaries.Place the sample on a glass slide and gently cover the sample with a coverslip. Then proceed to image the samples on a microscope capable of optical sectioning. This image shows a postnatal day five ovary which has not been cleared.Here, the ovary is shown one hour after the addition of clearing solution. The ovary will begin to become translucent within minutes of being submerged in clearing solution. Optical sectioning of cultured ovaries without clearing is possible, but cells deep within the tissue have a signal that is difficult to differentiate from background, which impedes proper oocyte quantification.In contrast, this representative image shows a cleared sample in which oocyte quantification throughout the entire organ is possible. While attempting this procedure, it's important to remember that antibodies have to diffuse through the tissue;thus, thicker tissues will require longer incubation time. After watching this video, you should have a good understanding of how to culture, stain, and image whole ovaries.The text describes the use of a free software, Fiji ImageJ, that can be used for simple follicle quantification. Don't forget that working with paraformaldehyde and sodium azide can be hazardous and precautions such as use of fume hoods and personal protective equipment should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

عزل بصيلات الشعر الخلايا الجذعية والخلايا الكيراتينية البشرة من الجلد الظهرية ماوس

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...