Name: whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00
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Wir danken Rebecca Williams und Johanna Dela Cruz von der Cornell-BRC-Imaging und Andrew Recknagel für Anregungen und technische Hilfe. Diese Arbeit wurde auf der National Institutes of Health Zuschuss unterstützt S10-OD018516 (an Cornells Imaging Facility), T32HD057854, J.C.B und R01-GM45415, J.C.S.

Cornell University institutionelle Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) hat alle Methoden, die hier beschrieben wird, in 2004-0038-Protokoll zu JCS zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
<ol><li>Wischen Sie der Arbeitsbereich mit 10 % Bleichmittel reinigen und lassen Sie das Bleichmittel auf die Arbeitsfläche Bereich mindestens 5 min lang zu bleiben. Entfernen Sie nach 5 min das überschüssige Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 % Ethanol (EtOH). R...

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis.">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10 (2011).</li><li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

Das Studium der Säugetier-Wiedergabe erfordert verwenden und Quantifizierung von spezialisierten Zellen, die nicht routinemäßig Zellkultur zugänglich sind. Ex-Vivo -Kultur-Systeme sind jedoch wirksam am Eierstock und Follikel Lebensfähigkeit1,15beibehalten. Während der Eierstock Kultur erfordert das Gewebe eine größere Fläche für den Austausch von Nährstoffen durch Diffusion. Also, 5 - Tage alten Maus Eierstöcke eignen sich in Größe und For...

Um die zelluläre Zusammensetzung und morphologischen Merkmale von Säugetieren Eierstöcke zu studieren, setzen Wissenschaftler oft auf in Vivo Experimente gefolgt von immunohistologische Anfärbung der Eierstöcke Paraffin eingebettet. Vor kurzem, obwohl ganze Eierstock Orgel Kultur erwiesen hat eine effektive Alternative zu eierstockfunktion1,2,3,4 zu studieren, weil die Technik mit besseren Visualisierung gekoppelt werden kann und Quantifizierung Werkzeuge. Traditionell, hängt Analyse der Eierstöcke Morphologie von Rekonstruktion dreidimensionaler Eierstock Architektur von Schnittserien Paraffin eingebettet, aber abgesehen davon, dass mühsam und zeitaufwendig, seriell Paraffin eingebettete Gewebe schneiden tut nicht garantiert korrekte Rekonstruktion der Orgel, und Abschnitte oft verloren gehen oder falsch bestellte in den Prozess.
Neben den technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit seriellen Schnitt gibt es auch Unterschiede in den Methoden routinemäßig verwendet, um Follikel Nummern pro Eierstock5,6zu quantifizieren. Die methodische Variabilität derzeit verwendet beeinträchtigt Meta-Analyse der ovariellen Reserve über Studien5,7. Zum Beispiel können Follikel Zahlen aus verschiedenen wissenschaftlichen Artikeln von 10-divisibel oder mehr zwischen ähnlichen Entwicklungsstörungen Alters innerhalb einer bestimmten Belastung6variieren. Diese großen Unterschiede in den gemeldeten Follikel Quantifizierung können zu Verwirrung führen und Kreuz-Studie Vergleiche behindert haben. Experimentell, traditionelle Ansätze zur Quantifizierung der Follikel von Schnittserien von zählen Follikel eine vordefinierte Anzahl von Abschnitten ausgeführt werden (z. B. jeden fünften, zehnten, oder anderen Abschnitt). Variabilität im Follikel zählt mit diesem Ansatz entsteht nicht nur aus der Periodizität in welche Abschnitte gezählt werden, sondern auch von Variationen in Schnittdicke und technische Erfahrung in der Erzeugung von Schnittserien5,6. Zusätzlich zu ihrer Variabilität ist ein weiterer Nachteil der traditionellen Gewebe zu schneiden, dass die schneiden kleine Eierstöcke von jungen Tieren besonders anspruchsvoll und stark abhängig von Gewebe Orientierung8.
Das Protokoll unten beschreibt eine routinemäßig verwendeten Eierstock Kultur Technik1 aber stark verbessert traditionelle Follikel Quantifizierung durch Substitution von physischen Schneiden mit Gewebe clearing und optischer Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie8 ,9. Clearing mit Gewebe Eintauchen (ohne die Notwendigkeit für Transkranielle Perfusion oder Elektrophorese) in eine Harnstoff - und Sorbit-basierte Lösung (z. B. ScaleS(0)10) erwies sich mit der Immunostaining kompatibel und erlaubt für die Reduzierung der Clearing-Zeit ohne Tiefe der Bildgebung. Andere berichteten Methoden (z.B., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12und ClearT212) sind entweder mehr Zeit verbrauchen oder erlauben keine gründliche optischen Auflösung der Probe. Optischer Schnitt ist vorteilhaft, weil es weniger arbeitsintensiv und die Orgel dreidimensionale Architektur7,8 unterhält. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Vorbereitung der Proben erfordert keine teure Reagenzien um das Gewebe zu löschen und kann mit relativer Mühelosigkeit durchgeführt werden.
Insbesondere das Protokoll beschrieben wurde optimiert für kultivierten Maus Eierstöcke bei postnatalen Tag fünf aber am Eierstock von postnatale Tag 0 - 10 durchgeführt wurde. Die Methode nutzt ein Eierstock Kultursystem, in dem das Gewebe natürlich auf die Membran auf dem kultiviert legt, Orgel Bearbeitung und Manipulation zu erleichtern. Das beschriebene Kultursystem kann verwendet werden, zu pflegen, dass Eizelle überleben13explantierten Eierstöcke für bis zu 10 Tage und zu beurteilen, wie die verschiedenen experimentelle Bedingungen stören können. Die Quantifizierung beschrieben erfolgt mit Hilfe der nichtkommerziellen Bildverarbeitungs-Paket Fidschi-ImageJ14 und kann auf den meisten PCs durchgeführt werden. Darüber hinaus können Bilder zur Quantifizierung weithin verfügbar für die wissenschaftliche Gemeinschaft, damit zukünftige Meta-Analyse erfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Micro dissecting scissor 4.5&#34;, straight, sharp points</td>
			<td style="width:200px;">Roboz</td>
			<td style="width:117px;">RS-5912</td>
			<td style="width:224px;">Micro dissecting scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jewelers style forceps 4-3/8&#34;, style 5</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Fine tip forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Iris Scissors 4&#34;, straight, sharp points</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-1618</td>
			<td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Minimal Essential Media (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Used in Step 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm Tissue Culture Treated Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nunc&#8482; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>141006</td>
			<td>Pore size: 8&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutator mixer GyroTwister&#8482;</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S1000-A-B</td>
			<td>three dimensional shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103219-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride solution (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl Alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>Cold water soluble</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM 163A</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-MVH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td>Dilution 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-mouse 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-rabbit 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(-)sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240850-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI-ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414044-034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

Forschung auf dem Gebiet der Säugetier-Reproduktionsbiologie umfasst oft die Auswertung des Gesamtzustand der Eierstöcke und Hoden. Insbesondere bei Frauen, Eierstöcke Fitness oft bemisst sich durch Visualisierung und Quantifizierung der Follikel und Eizellen. Da der Eierstock eine undurchsichtige dreidimensionale Gewebe ist, erfordern traditionelle Ansätze mühsam Schneiden des Gewebes in zahlreichen Schnittserien um Zellen im ganzen das ganze Organ sichtbar zu machen. Darüber hinaus da Quantifizierung von dieser Methode in der Regel nur eine Teilmenge der in den Abschnitten, die getrennt von der ungefähre Durchmesser eine Eizelle erzielte umfasst, ist es anfällig für Ungenauigkeit. Hier wird ein Protokoll beschrieben, die stattdessen nutzt ganze Organ Gewebe Clearing und Immunfluoreszenz-Färbung der Maus Eierstöcke Follikel und Eizellen zu visualisieren. Im Vergleich zu traditionellen Ansätzen, dieses Protokoll ist vorteilhaft für die Visualisierung von Zellen innerhalb des Eierstocks aus vielerlei Gründen: 1) der Eierstock bleibt im gesamten Probenvorbereitung und Verarbeitung; (2) kleine Eierstöcke, die schwer zu Abschnitt sind, können mit Leichtigkeit untersucht werden; (3) zellulären Quantifizierung wird leichter und genauer erreicht; und 4) das gesamte Organ abgebildet.

Dieses Protokoll enthält 6 große Schritte folgen Dissektion der Eierstöcke, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 , Abbildung 3 , Abbildung 4 markieren Sie die neuen Features dieses Protokolls, die Optimierung des Gewebes clearing für Eierstöcke und ganze Gewebe Eizelle Quantifizierung mit Fidschi-ImageJ ent...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...