Name: whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries at JoVE.com

有用な提案や技術支援、レベッカ ・ ウィリアムズとコーネル BRC イメージングからヨハンナ Dela クルスとアンドリュー Recknagel に感謝します。この作品は国立衛生研究所健康補助金に支えられた (コーネル大学のイメージング施設) に S10 OD018516、J.C.B. に T32HD057854、J.C.S. に R01 GM45415

コーネル大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、議定書 2004-0038 JCS にここでは、記載されているすべてのメソッドを承認しました。
1. 楽器及び培地の調製
<ol><li>ワイプ作業領域 10% の漂白剤できれいにでき、漂白剤を少なくとも 5 分作業エリア表面上に残ります。5 分後に、きれいなペーパー タオルと 70% のエタノール (エタノール) 余分な漂白剤を削除します?...

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sampling+on+the+reproducibility+of+ovarian+follicle+counts+in+mouse+toxicity+studies.">Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies.</a> Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).</li><li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Generated+Ovaries+to+Assist+Follicle+Counting+Experiments.">Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).</li><li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole-Mount+Approach+for+Accurate+Quantitative+and+Spatial+Assessment+of+Fetal+Oocyte+Dynamics+in+Mice.">A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis.">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10 (2011).</li><li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

哺乳類の生殖に関する研究では、細胞培養に日常的に従順ではない特殊な細胞を定量化して、必要があります。ただし、体外培養システムは、卵巣と卵胞の生存率1,15を維持に効果的です。子房培養中に組織拡散を介して栄養素の交換のため表面積が必要です。したがって、5 日間の古いマウス卵巣のサイズが理想的との器官培養形状します?...

細胞構成と哺乳類の卵巣の形態学的特徴を研究するために科学者はしばしば免疫組織学的染色パラフィン埋め込まれた卵巣の続く生体内で実験に依存します。もっと最近しかし、完全な卵巣器官培養が技術することができますより良い可視化と結合するために卵巣機能1,2,3、4を勉強する効果的な代替であると証明し、数量化ツールです。伝統的に、卵巣の形態解析パラフィン埋め込まれた連続切片から、骨の折れる、時間がかかり、連続パラフィン埋め込まれたティッシュの区分であることに加えて再構築の三次元の卵巣アーキテクチャによって異なりますオルガンのない保証の適切な再建をしないとセクションがしばしば紛失またはプロセスで注文ミス。
シリアルセクショニングに関連する技術的な課題に加えて、日常的に卵巣5,6あたりの卵胞数を定量化するために使用方法の変化もあります。現在使用されている方法論的変動研究5,7を越え卵巣予備のメタ分析を損ないます。たとえば、異なる研究論文から卵胞数 10 倍以上特定のひずみ6内と同様の発達年齢間によって異なります。報告された卵胞定量化にこれらの大きな違いは混乱を招く可能性し、クロス研究比較を妨げています。セクションのあらかじめ定義された数の卵胞をカウントすることによって連続切片から卵胞定量化への従来のアプローチを実行する実験的に (例えば、すべての 5 番目、10 番目、または他のセクション)。このアプローチを使用して卵胞数の変動は、切片厚で連続切片5,6を生成する際に技術的な経験だけでなく、セクションはカウント、周期性変化からもを発生します。その変動に加え伝統的なティッシュの別の欠点は、若い動物から小さな卵巣の断面が特に挑戦的な組織向き8に大きく依存することです。
以下のプロトコルは日常的に使用される卵巣文化技術1を記述しますが、クリア組織の物理的な区分および共焦点顕微鏡8 を用いた光学セクショニングを置き換えることによって伝統的な卵胞の定量化に大幅に向上 ,9。クリアで、尿素およびソルビトール ベース組織浸漬 (経頭蓋灌流または電気泳動なし) を使用してソリューションを (例えば、 ScaleS(0)10)、免疫染色と互換性があることを証明し、の減少のため許可イメージングの深さを損なうことがなく時間をクリアします。その他の報告の方法 (例えばScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12、および ClearT212) より多くの時間がかかるまたはサンプルの詳細な光学解像度を許可しません。光の断面は、以下の労働集約型であり臓器の三次元アーキテクチャ7、8を保持ため便利です。このアプローチの別の利点は、サンプルの準備組織をクリアする高価な試薬を必要としない比較的容易に行うことができます。
具体的には、説明されたプロトコルは生後 5 日目の培養マウス卵巣に最適化されていますが、生後 0 - 10 から卵巣を実施しました。メソッドでは、組織が自然にそれが培養、臓器処理や操作を促進する膜につく卵巣培養系。説明文化システムは、explanted 卵巣 10 日間までとどのように異なる実験条件を評価するためには、卵母細胞生存13を妨げる可能性を維持するために使用できます。定量化手順処理パッケージ フィジー ImageJ14非商用画像を使用してされるので、ほとんどのパーソナル コンピューターで行うことができます。さらに、将来のメタ分析することができます、科学的なコミュニティのため、定量化に使用するイメージを広く利用可能にすることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Micro dissecting scissor 4.5&#34;, straight, sharp points</td>
			<td style="width:200px;">Roboz</td>
			<td style="width:117px;">RS-5912</td>
			<td style="width:224px;">Micro dissecting scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jewelers style forceps 4-3/8&#34;, style 5</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Fine tip forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Iris Scissors 4&#34;, straight, sharp points</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>18-1618</td>
			<td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Minimal Essential Media (MEM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Used in Step 1.3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm Tissue Culture Treated Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Nunc&#8482; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>141006</td>
			<td>Pore size: 8&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutator mixer GyroTwister&#8482;</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S1000-A-B</td>
			<td>three dimensional shaker</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103219-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bovine Serum Albumen (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride solution (NaBH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl Alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>Cold water soluble</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93443-100ML</td>
			<td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL Syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM 163A</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-MVH antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td>Dilution 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-mouse 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor&#174; goat anti-rabbit 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(-)sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240850-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FIJI-ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414044-034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

哺乳類の生殖生物学の分野の研究は、卵巣と精巣の全体的なヘルスを評価をしばしば伴います。具体的には、女性の卵巣のフィットネス頻繁の可視化と定量化卵胞と卵子によって評価されます。卵巣は、不透明な三次元組織は、従来のアプローチは苦心して全体の臓器中の細胞を可視化するために数多くのシリアル セクションにティッシュをスライスを必要です。さらに、このメソッドによって定量化は通常卵のおおよその直径で区切られたセクションのサブセットのみを得点を伴う、ので、不正確になりやすいです。ここでは、プロトコルは、全臓器組織の清算とマウス卵巣卵胞と卵子を視覚化するための免疫蛍光染色を代わりに利用した、説明します。伝統的なアプローチと比較して、このプロトコルは多くの理由で卵巣内の細胞を可視化するため有利である: 1) 卵巣試料調製及び処理全体はそのままセクションすることは困難である 2) 小さな卵巣は容易に調べることができます。3) 携帯電話の数量化をより容易にかつ正確に達成します。・ 4) イメージ全体の器官。

このプロトコルには、六つの主要なステップが含まれている次の卵巣の解剖図 1で説明したよう。図 2, 図 3, 図 4卵巣及びフィジー ImageJ を用いた全ティッシュ卵定量化のクリア組織の最適化を含むこのプロトコルの最も斬新な機能を強調表?...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

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Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

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