Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" من خلال جائزة مهنة (رقم المنحة DBI 1253293)؛ المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (أرقام المنح HG007233-01، R01-EB019453-01، 1R21HG007233، DP2-AR068129-01، R01-HG008978)؛ و "الدفاع المتقدم البحث مشاريع الوكالة يعيشون المسابك البرنامج" (العقد رقم HR0011-12-ج-0065، N66001-12-ج-4211، HR0011-12-ج-0066).

<ol>
	<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients.">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li><li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+islands+in+bacterial+pathogenesis.">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li><li>Mart&#237;nez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection:+pathogenicity+epidemicity,+and+antibiotic+resistance.">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+for+single+cells.">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li><li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing.">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics.">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+labeling+(Hi-SCL)+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics.">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li><li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing.">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing.">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784 (2016).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding.">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li><li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions.">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li><li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota.">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li><li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering.">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).</li><li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics.">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).</li><li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun.">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment.">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).</li><li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes.">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li><li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+metagenomic+sequences:+methods+and+challenges.">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing.">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).</li><li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+helix+in+a+haystack:+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics.">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li></ol>

براءات الاختراع المتعلقة بسير العمل هذا قد تكون مرخصة "البعثة السيرة الذاتية"، أباتي ر آدم الذي هو أحد المساهمين.

سير العمل موائع جزيئية SiC seq تنتج بيانات تسلسل جينوم خلية واحدة من آلاف خلايا البكتيرية. الرموز الشريطية الرقمية تقسم على مورثات الخلايا مغلفة ميكروجيل تسمح deconvolution في السيليكون خ ع البيانات إلى مجموعات من يقرأ المراقب التي تنشأ من خلية واحدة. تجربة التحكم مع مجتمع الميكروبي لتكوين المعروفة أمر ضروري لتقييم نقاء المجموعات الباركود. جزء كبير من المجموعات المنخفضة-نقاء يشير إلى أن معدل تغليف خلية مرتفع للغاية، أو أن هناك التلوث عبر التجميعية الهامة التي تحدث أثناء خطوات المعالجة موائع جزيئية. وفقا لإحصاءات بواسون، ينبغي تغليف الرموز الشريطية والخلايا بنسبة مستهدفة من الجسيمات 1 لكل 10 قطرات الحد من معدل الأحداث تغليف متعددة إلى أقل من 5 في المائة من جميع قطرات غير فارغة. سعر تغليف أعلى من هذا يزيد معدلات doublets أضعافاً مضاعفة، حتى تحقق نسبة التغليف أثناء عملية دروبماكينج ذات أهمية حاسمة. ينبغي أن يكون المستخدمين الحذر خاصة لتغليف خلايا متعددة في ميكروجيل واحد لأنه لا يمكن أن يقرأ من خلايا مختلفة تقاسم نفس تسلسل الباركود بيوينفورماتيكالي مفصولة. في الحالة يتلقى تلك الخلية 1 2 الرموز الشريطية مختلفة، نقاء المجموعة رمز شريطي، لا تتأثر على الرغم من أن قياسات الوفرة هي منحرفة عند عد بتسلسل الباركود.
التلوث عبر الحبرية قد تنشأ أيضا بسبب ظروف الاندماج دون الحد الأمثل. أثناء عملية ناجحة، يمكن أن كنترولبلي زوج الجهاز الاندماج موائع جزيئية (الشكل 5) 1 الحبرية الباركود مع ميكروجيل 1 وحجم الكاشف PCR. سيؤدي إلى معدلات التدفق المثالي عدم معالجة تجميعية الأقران في نسب غير صحيحة: 1 الباركود يمكن أن يقترن ميكروجيلس 2، على سبيل المثال. المقصود أن تكون تقديرات معدلات تدفق جميع المدرجة في البروتوكول وقد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لاختلافات طفيفة في أحجام التجميعية وهندسة الجهاز. المستخدمين الذين لديهم وصول للكاميرات مع قدرات تسجيل عالية السرعة (> إطارات 10,000/s) ينبغي التحقق من عملية الدمج الصحيح الحبرية في البداية وعلى مدى العملية موائع جزيئية. يمكن للمستخدمين دون الحصول على كاميرا عالية السرعة جمع كمية صغيرة من الإخراج المدمجة وقياس أحجام الحبرية تحت مجهر يدوياً. يجب أن يكون حجم الحبرية موحدة: فائض في الباركود غير مدمجة أو قطرات ميكروجيل يشير إلى أنه ينبغي خفض معدلات حقن تبعاً لذلك.
ينبغي اتخاذ عدة احتياطات عامة عند التعامل مع ميكروجيلس وميكرودروبليتس للحفاظ على سلامتهم. ميكروجيلس، على الرغم من أن قوي ميكانيكية، يجب أن يكون بما فيه الكفاية تبرد قبل كسر والغسيل خطوات لضمان جيلاتيون كاملة. ميكروجيلس عدم كروية هي إشارة إلى أن [اغروس] لا تعطي الوقت الكافي لترسيخ. عند غسل ميكروجيلس، تدور التعليق أسفل السرعات المطلوبة لتجنب خسارة المنتج. المائية [اغروس] إنكسار عن كثب مطابقة للمياه وقد يكون من الصعب على انظر في أنبوب22، حيث المستخدمين ينبغي أن تحدد بدقة الحدود هلام السائل قبل تطلع. قطرات الماء في النفط معرضة للتلاحم بحشد قوات ثابتة23 في مختبر القفازات وأنابيب. لهذا السبب، نوصي بتحميل الحقن حقن الحبرية بأيديهم العارية وعلاج كافة الأسطر مع بندقية مكافحة ساكنة قبل فتيلة مضخة حقن. يمكن إزالة قطرات كبيرة ملتئم بالتناوب المستحلبات في حقنه ببطء ويدويًا يسفط قطرات أكبر، التي تتراكم بالقرب من أعلى بسبب قوتها ازدهار أكبر.
Seq سيك هو أول تقنية لإظهار تسلسل جينوم خلية واحدة > 50,000 الخلايا البكتيرية. هذا البرنامج يوفر مزايا كبيرة في إنتاجية أكثر من النهج القائمة وتمكن أعمق لأخذ عينات من المجتمعات الميكروبية غير متجانسة. وحتى الآن استخدمت التكنولوجيات موائع جزيئية لتسلسل جينوم خلية واحدة ميكروتشامبيرس9 وميكروويلس24 لعزل الخلية والتضخيم، ولكن مع الوسيطة في نطاق فقط من عشرات إلى مئات خلايا. تدفق فرز الخلايا المفردة في ويلبلاتيس5،6 يتطلب لا الأجهزة المتخصصة موائع جزيئية ولكن يمتلك إنتاجية منخفضة على نحو مماثل. نظراً لأن عينات التربة والمياه من البيئة قد يشيع التنوعات ألفا > 1,000 في هذه الأنواع من المستوى25،26، SiC seq مفيد جداً بحكم قدرته على العينة عدد أكبر بكثير من الكائنات الحية. يكون سير العمل SiC seq قابلة للتكيف للمدخلات الخلية من مختبر الثقافة، والبيئة الطبيعية، أو مضيف معيشة. عينة خلية تحتاج فقط في وقف مائي وخالية من جزيئات كبيرة (> 10 ميكرون) تكون مناسبة لتغليف موائع جزيئية. على سبيل المثال، الأسلوب قد طبق سابقا على عينة من مياه البحر باستخدام سلسلة من المياه والصرف الصحي وتصفية خطوات لعملية ما قبل الخلايا قبل تغليف17.
البروتوكول SiC seq يولد كمية ضئيلة نسبيا من تسلسل البيانات من كل خلية مفردة، وقد لا تكون مناسبة لجميع التطبيقات. تتطلب بعض خوارزميات المعلوماتية الحيوية مثل الجمعية الجينوم حيثياته أو متغير واحد النوكليوتيدات (الهولندية) تطلق على أعماق تغطية أكبر للعمل بفعالية. بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون مجموعات الرمز الشريطي متفاوت المسافات في السيليكون التصنيفية binning أساليب27 حيث أنه يمكن تطبيق الخوارزميات في مجموعات أكبر من ما يلي. يجوز كفاءة سير العمل SiC seq المتوازية الشاملة منخفضة نسبيا أيضا تحديات في الحالات التي يكون فيها توافر العينة الإدخال المنخفضة. Seq سيك ويعتمد على خطوة تغليف توزيع Poisson باركود، ولذلك تلقي رمز شريطي جزيئي حوالي 10% الخلايا وتتضخم خلال الخطوة إعداد مكتبة النهائي. بينما هذا يماثل الأخرى المستندة إلى ميكرودروبليت المتوازية مخططات10، المستخدمين الذين يعملون مع عينات الخلايا الثمينة قد يجدون صعوبة في تحقيق العائد مكتبة كافية للتسلسل وقد تحتاج إلى زيادة عدد دورات PCR في النهائي الخطوة التضخيم. حل محتمل آخر للمستخدمين ذوي الخبرة موائع جزيئية لفرز قطرات الباركود إيجابية بعد الخطوة PCR الرقمية، مما يجعل كفاءة المتوازية الشاملة > 85%28.
اتجاه مستقبل محتمل للتكنولوجيا SiC seq هو تكييف سير العمل للاستخدام مع خلايا الثدييات، مما يمهد الطريق للجديد من الدراسات السريرية في خلية واحدة. على سبيل مثال، خلايا تحليل التباين رقم نسخة بين السرطان واحد أيار زيادة فهمنا لدور عدم التجانس في أمراض السرطان2. وبدلاً من ذلك، سيمكن دمج SiC seq مع الأساليب القائمة التحقيق وإثراء تسلسل الحمض النووي لفائدة29 تسلسل وحيدة الخلية المستهدفة من الفئات السكانية الفرعية أو السلالات النادرة من الخلايا. مع العينات البيئية، يمكن استهداف الجينات من ضمن مسار التمثيل الغذائي معروفة وتحليلها سياقياً جنبا إلى جنب مع جينات للتعرف على رواية المجينية الجزر المجاورة. من داخل بيئة الإنسان مضيف، عينات عيار منخفض البكتيريا المسببة للأمراض يمكن أن تكون معزولة ومتسلسلة على مستوى خلية واحدة لدراسة المزيد عن كثب أصولهم أوضح من ضراوة.

الجينوم بمثابة مخططا للهوية الخلوية والدالة، التي تحتوي على الكائن الحي بأكملها الترميز المحتملة. فهم البيولوجيا الخلوية على مستوى الجينوم يمكن أن تفسر تنوع المظهرية ملاحظتها داخل الخلية غير المتجانسة السكان. هذا التباين الواضح في الأنظمة البيولوجية، وله آثار واسعة النطاق على صحة الإنسان والمرض. على سبيل المثال، ترتبط الجينات نسخ عدد الاختلافات بين الخلايا السرطانية لتطور وانتشار السرطان1،2. في العدوى البكتيرية، الإمراضية جزر موجودة في جزء صغير من الجينوم يمكن نقلها أفقياً، ويؤدي إلى انتشار البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية3،4. هو تحدي الرئيسي في دراسة الجينوم على مستوى الخلايا المفردة كميات منخفضة من الحمض النووي المتاحة، فضلا عن الحاجة إلى تحليل آلاف خلايا العينة التنوع الكامل للأنماط الجينية. لهذه الأسباب، أعاقت القيود الإنتاجية التجريبية فعالية الدراسات خلية واحدة، يتحامل نتائج نحو الخلايا الأكثر وفرة. تقنيات عزل خلية واحدة مثل تدفق الفرز5،6، ملاقط بصرية7، امبيدمينت في معظم المواد الهلامية8، وميكروفلويديكس9 قادرون على تجهيز مئات خلايا لتسلسل؛ ومع ذلك، يمثل هذا جزء صغير فقط من معظم العينات. يسمح أسلوب لتسلسل جينوم خلية واحدة مع إنتاجية أعلى بكثير التنميط أكثر عمقاً وأكثر اكتمالا من السكان الخلية، وبالتالي توضيح دور أوضح التنوع داخل هذه المجتمعات.
ميكروفلويديكس الحبرية يتيح التلاعب الفائق بالخلايا والمواد الكاشفة البيولوجية داخل ملايين مفاعلات بيكوليتير-مقياس. وحتى الآن، ميكرودروبليت قد استخدمت تقنيات لدراسة أنماط التعبير التفاضلية بين خلايا من أنسجة غير متجانسة10،،من1112، عميق تسلسل جزيئات طويلة13،14 ،15، وسلوك الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (الرقائق-seq) تحليلات بشأن خلايا مفردة16. وفي الواقع، ميكرودروبليتس قادرون على عمليات الفائق، ومجزأة، وجعلها قابلة للتطبيقات في علم الجينوم خلية واحدة. تطوير هذه التكنولوجيا يعرض التحديات التكنولوجية الفريدة الخاصة به، ومع ذلك. يجب تفكيك الخلايا وتنقية وتضخيم مع التحيز الحد الأدنى، إلى شكل موحد عينة خلية السكان. بالإضافة إلى ذلك، خلافا للنصوص مرناً بوليادينيلاتيد في خلايا الثدييات، هناك لا فكرة الجزيئية قابلة للمقارنة في الجينوم لتسهيل القبض على الحمض النووي المستهدف. ولهذه الأسباب، قد يصعب تنفيذه في منصات ميكرودروبليت تسلسل جينوم خلية واحدة.
في هذا العمل، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنهجنا ذكر سابقا موائع جزيئية خلية واحدة قادرة على تسلسل جينوم عشرات آلاف خلايا في تجربة واحدة17. مغلفة في النطاق ميكرون الهلاميات المائية مع هذه التكنولوجيا، ودعا SiC-seq، الخلايا البكتيرية وتفكيك فردياً، تاجمينتيد، واندمجت مع ميكرودروبليت الذي يحتوي على رمز شريطي اليغنوكليوتيد فريدة من نوعها، وهي تقسم على الحمض النووي للخلية عن طريق تداخل واحد ملحق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الهلاميات المائية مثابة حاويات معزولة فيها عالية الوزن الجزيئي المجينية الحمض النووي هو ستيريكالي المغطى، السماح لجزيئات أصغر مثل المنظفات والأنزيمات الحال للوصول وتنقية الحمض النووي قبل المتوازية18. هذا البروتوكول العمليات > 50,000 الخلايا المفردة في غضون ساعات، أسفر عن المراقب مكتبة جاهزة للتسلسل. عقب التسلسل، ما يلي: ديمولتيبليكسيد وفقا لتسلسلها الباركود خلية واحدة، أدى إلى dataset تتألف من ملايين القراءات، كل مع فهرس خلوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

تقنيات التسلسل شهدت تحولاً من الأكبر إلى خلية واحدة القرار استجابة لفهم دور التغايرية الخلوية متطورة في النظم البيولوجية. ومع ذلك، تسلسل خلية واحدة كبيرة من السكان قد أعاق القيود في تجهيز الجينوم للتسلسل. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة لتسلسل جينوم خلية واحدة (SiC-seq) الذي يستخدم ميكروفلويديكس الحبرية إلى عزل، وتضخيم، والرمز الشريطي الجينوم للخلايا المفردة. تغليف الخلية في ميكروجيلس يسمح بتنقية مجزأة وتاجمينتاتيون من الحمض النووي، بينما اندماج موائع جزيئية أزواج كفاءة كل الجينوم مع رمز شريطي فريد اليغنوكليوتيد خلية واحدة، مما يتيح > 50,000 الخلايا المفردة تكون متسلسلة كل تشغيل. هو ديمولتيبليكسيد البيانات التسلسل بالرمز الشريطي، توليد مجموعات من القراءات التي تنشأ من خلايا مفردة. كأسلوب الإنتاجية العالية والمنخفضة-التحيز في تسلسل خلية واحدة، سيمكن SiC seq طائفة أوسع من الدراسات الجينومية تستهدف السكان خلية المتنوعة.

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

يكشف تسلسل خلية واحدة قد تغاير في النظم البيولوجية، ولكنها تفتقر إلى التكنولوجيات الحالية الإنتاجية اللازمة للتنميط العميقة وظيفة وتكوين المجتمع. هنا، يمكننا وصف سير عمل موائع جزيئية للتسلسل > خلية 50,000 جينوم خلية واحدة من تنوع السكان.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

ترتيب القراءة طويلة جداً لتحليل الحمض النووي كله

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...