Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation gennem en karriere Award (grant antallet DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (grant nummer HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); og Defense Advanced projekter agentur bor støberier forskningsprogrammet (kontraktnumre HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol>
	<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients.">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li><li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+islands+in+bacterial+pathogenesis.">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li><li>Mart&#237;nez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection:+pathogenicity+epidemicity,+and+antibiotic+resistance.">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+for+single+cells.">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li><li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing.">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics.">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+labeling+(Hi-SCL)+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics.">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li><li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing.">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing.">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784 (2016).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding.">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li><li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions.">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li><li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota.">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li><li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering.">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).</li><li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics.">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).</li><li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun.">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment.">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).</li><li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes.">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li><li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+metagenomic+sequences:+methods+and+challenges.">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing.">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).</li><li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+helix+in+a+haystack:+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics.">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li></ol>

Patenter vedrørende denne arbejdsproces kan være er licenseret til Mission Bio, af hvilke Adam R. Abate aktionær.

SiC-seq mikrofluid arbejdsproces producerer encellede genome sequencing data fra tusindvis af bakterieceller. Digital stregkoder splejset på genomer af microgel-indkapslede celler giver mulighed for i siliciummangan -deconvolution NGS data i grupper af barcoded læsninger stammer fra den samme celle. En kontrol eksperiment med en mikrobielle samfund med kendt sammensætning er nødvendige for at vurdere renhedsgraden af grupperne stregkode. En stor del af lav-renhed grupper angiver at celle indkapsling sats er for høj eller at der er betydelige droplet krydskontaminering opstår under mikrofluid behandlingstrin. Ifølge Poisson statistikker, bør stregkoder og celler være indkapslet i target forholdet 1 partikel for hver 10 dråber til at begrænse antallet af flere indkapsling begivenheder til mindre end 5% af alle ikke-tomme dråber. En indkapsling rente højere end dette øger satserne for dubletter eksponentielt, så kontrol af indkapsling forholdet under dropmaking processen er af afgørende betydning. Brugere bør være særligt forsigtige for indkapsling af flere celler i et enkelt microgel fordi læsninger fra forskellige celler deler den samme stregkode sekvens ikke kan være bioinformatically adskilt. I tilfældet at 1 celle modtager 2 forskellige stregkoder, stregkode gruppe renhed er upåvirket, selvom overflod metrics er skæv ved optælling af stregkode sekvens.
Droplet krydskontaminering kan også opstå som følge af suboptimal fusion betingelser. Under en vellykket operation, kan mikrofluid fusion enhed (figur 5) controllably par 1 stregkode droplet med 1 microgel og en mængde af PCR reagens. Ikke-ideelle strømningshastigheder vil resultere i en droplet parring på forkert nøgletal: 1 stregkode kunne kombineres med 2 microgels, f.eks. Alle strømningshastigheder opført i protokollen er beregnet til at blive skøn og skal måske justeres afhængigt af små variationer i enheden geometri og slipværktøj størrelser. Brugere med adgang til kameraer med high-speed optagelse evner (> 10.000 rammer/s) skal kontrollere den korrekte droplet fusion i begyndelsen og i løbet af handlingen mikrofluid. Brugere uden adgang til et højhastighedskamera kan indsamle en lille mængde af den flettede output og manuelt måle droplet størrelser under et mikroskop. Dråbestørrelse bør være ensartet: et overskud af uflettede stregkoder eller microgel dråber angiver at reinjektion priser bør reduceres tilsvarende.
Flere generelle forholdsregler bør tages ved håndtering af microgels og microdroplets til at bevare deres integritet. Microgels, skal selvom mekanisk robust, være tilstrækkeligt køles før bruddet og vaske trin for at sikre komplet gellation. Ikke-sfæriske microgels er en indikation af, at Agarosen ikke var får tilstrækkelig tid til at størkne. Når du vasker microgels, spin suspensioner ned på de krævede hastigheder til at undgå tab af produktet. Agarosen hydrogel har en refraktivt indeks tæt matchende vand og kan være svært at se i en tube22, så brugere bør omhyggeligt identificere gel-flydende grænse før aspiration. Vand i olie dråber er modtagelige for sammensmeltning af ophobning af statisk styrker23 på laboratoriet handsker og slanger. Vi anbefaler derfor, lastning droplet reinjektion sprøjter med bare hænder og behandling af alle reinjektion linjer med en anti-statisk pistol før pumpen priming. Store sammenvoksede dråber kan fjernes ved langsomt roterende emulsioner i en sprøjte og manuelt sugning de større dråber, der akkumulerer øverst på grund af deres større livlig kraft.
SiC-seq er den første teknologi til at vise encellede genome sequencing af > 50.000 bakterieceller. Denne platform giver betydelige fordele i overførselshastighed over eksisterende metoder og giver mulighed for en dybere prøveudtagning af heterogene mikrobielle samfund. Til dato har mikrofluid teknologier til én celle genome sequencing ansat microchambers9 og microwells24 for celle isolation og forstærkning, men med gennemløb i rækken af kun snesevis til hundredvis af celler. Flow sortering af enkelt celler til wellplates5,6 kræver ingen specialiserede mikrofluid instrumentation men besidder en tilsvarende lav dataoverførselshastighed. Som jord og vand prøver fra miljøet har almindeligt alpha mangfoldighedens af > 1.000 på arternes niveau25,26, SiC-seq er meget fordelagtigt i kraft af sin evne til at prøve et langt større antal organismer. SiC-seq arbejdsprocessen er fleksibel til celle input fra laboratoriet kultur, det naturlige miljø eller en levende vært. En celle prøve må kun være i en vandig suspension og fri for store partikler (> 10 µm) egnet til mikrofluid indkapsling. For eksempel, er metoden anvendt tidligere til en stikprøve af havvand ved hjælp af en række vask og filtrering trin for at pre-behandle celler før indkapsling17.
SiC-seq protokol genererer en forholdsvis sparsom mængde sequencing data fra hver enkelt celle og kan ikke være egnet til alle applikationer. Nogle Bioinformatik algoritmer som de novo genom forsamling eller enkelt nucleotid variant (SNV) ringer kræver højere dækning dybder til at arbejde effektivt. I stedet, stregkode grupper kan være grupperet i siliciummangan af taksonomiske binning metoder27 så algoritmer kan anvendes på større sæt af læser. Relativt lave samlede stregkodesystem effektivitet SiC-seq arbejdsprocessen kan også præsentere udfordringer i tilfælde, hvor tilgængeligheden af input prøven er lav. SiC-seq bygger på en Poisson-distribueret stregkode indkapsling skridt, derfor ca 10% af cellerne modtager en molekylær stregkode og forstærkes under den endelige bibliotek præparationstrin. Mens dette kan sammenlignes med andre microdroplet-baserede stregkodesystem ordninger10, brugere, der arbejder med dyrebare celle prøver kan have svært ved at opnå tilstrækkelig bibliotek udbytte til sekvensering og kan være nødvendigt at øge antallet af PCR cyklusser i finalen forstærkning trin. En anden mulig løsning til brugere med mikrofluid ekspertise er at sortere positive stregkode dråber efter trinnet digital PCR, hvorved den samlede stregkodesystem effektivitet > 85%28.
En potentiel fremtidig retning for SiC-seq teknologi tilpasser arbejdsproces til brug med pattedyrceller, baner vejen for nye kliniske encellede undersøgelser. Som et eksempel, en analyse af copy number variation blandt enkelt kræft celler kan fremme vores forståelse af heterogenitet i kræft patologi2rolle. Alternativt, integrere SiC-seq med eksisterende metoder til sonde og berige DNA sekvenser af interesse29 ville aktiverer den målrettede encellede sekvensering af delpopulationer eller sjældne stammer af celler. Med miljøprøver, kunne gener fra inden for en kendt stofskiftevej være målrettet og analyseret kontekstuelt sammen med nabolandet gener for at identificere roman genomisk øer. Fra inden for en menneskelig vært miljø, lav-titer patogene bakterier prøver kunne isoleres og sekventeret på én celle plan at undersøge mere nøje deres genotypiske oprindelsen af virulens.

Genomet, der fungerer som en blåstempling af cellulære identitet og funktion, som indeholder i sin helhed af en organisme kodning potentiale. En forståelse af cellebiologi på niveauet genom kan forklare de observerede fænotypiske mangfoldighed inden for heterogen cellepopulationer. Denne forskelligartethed viser sig i biologiske systemer og har omfattende konsekvenser for menneskers sundhed og sygdom. Eksempelvis er gen kopi nummer variationer blandt tumorceller knyttet til udvikling og spredning af kræft1,2. I bakterielle infektioner, patogenicitet øer i en lille brøkdel af genomer kan overføres horisontalt og føre til spredning af antibiotikaresistente bakterier3,4. En primære udfordring i at studere genomer på én celle-niveau er de lave mængder af DNA tilgængelige, samt behovet for at analysere tusindvis af celler til at prøve det fulde mangfoldighed af genotyper. Af disse grunde har begrænsninger i eksperimentel overførselshastighed hindret effektiviteten af encellede undersøgelser, påvirke resultaterne mod de mest rigelige celler. Encellede isolation teknikker såsom flow sortering5,6, Optisk pincet7, nedstøbning i bulk geler8og mikrofluidik9 er i stand til at behandle hundredevis af celler til sekvensering; Dette udgør dog kun en lille brøkdel af de fleste prøver. En metode til enkelt celle genome sequencing med væsentligt højere overførselshastighed ville give mulighed for dybere og mere komplet profilering af cellepopulationer, dermed belyse rollen af genotypiske mangfoldighed inden for disse samfund.
Droplet mikrofluidik giver høj overførselshastighed manipulation af celler og biologiske reagenser inden for millioner af picoliter-skala reaktorer. Til dato, microdroplet teknologier har været brugt til at studere differential udtryk mønstre blandt celler fra heterogen væv10,11,12, dybt sekvens lange molekyler13,14 ,15, og adfærd kromatin immunoprecipitation sekventering (ChiP-seq) analyser på enkelt celler16. Microdroplets er faktisk i stand til at høj overførselshastighed, opdelte operationer, hvilket gør dem imødekommenhed over for programmer i én celle genomforskning. Udviklingen af denne teknologi præsenterer sin egen unikke teknologiske udfordringer, dog. Celler skal mængden, renset og forstærket med minimal skævhed, at ensartet prøve cellepopulationer. Desuden, i modsætning til polyadenylated mRNA udskrifter i pattedyrceller er der ingen sammenlignelige molekylære motiv i genom til lette erobringen af target-nukleinsyre. Af disse grunde, har encellede genome sequencing været vanskeligt at implementere i microdroplet platforme.
I dette arbejde giver vi en detaljeret protokol af vores tidligere rapporteret encellede mikrofluid tilgang i stand til sekvensering genomer af titusinder af celler i et enkelt eksperiment17. Med denne teknologi, kaldet SiC-FF., bakterieceller indkapsles i micron-skala hydrogels og individuelt mængden, tagmented, og flettet med et microdroplet, som indeholder en unik oligonukleotid stregkode, som er splejset på cellens genomisk DNA via en enkelt overlapning udvidelse polymerase kædereaktion (PCR). Hydrogels tjene som isolerede beholdere, hvor høj molekylvægt genomisk DNA er sterically indkapslet, giver mulighed for mindre molekyler såsom rengøringsmidler og lytisk enzymer til at få adgang til og rense DNA før stregkodesystem18. Denne protokol processer > 50.000 enkelt celler i løbet af få timer, hvilket resulterer i en barcoded bibliotek klar til sekvensering. Efter sekvensering er læser demultiplexed ifølge deres encellede stregkode sekvens, hvilket resulterer i et datasæt bestående af millioner af læser, hver med en cellulær indeks.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

Sekventering teknologier har undergået et paradigmeskift fra bulk enkelt celle beslutning som reaktion på en voksende forståelse af rollen af cellulære heterogenitet i biologiske systemer. Dog er én celle sekventering af store befolkningsgrupper blevet hæmmet af begrænsninger i behandlingen af genomer til sekvensering. I dette papir beskriver vi en metode til encellede genome sequencing (SiC-seq) som bruger droplet mikrofluidik til at isolere, forstærke og stregkode genomer af enkelt celler. Celle indkapsling i microgels tillader opdelte rensning og tagmentation af DNA, mens en mikrofluid fusion effektivt par hver genom med en unik encellede oligonukleotid stregkode, tillader > 50.000 enkelt celler til at blive sekventeret pr. løb. Sequencing data er demultiplexed af stregkode, generere grupper af læser med oprindelse fra enkelt celler. Som en høj overførselshastighed og lav-bias metode af encellede sekventering giver SiC-seq en bredere vifte af genomisk undersøgelser rettet mod forskellige cellepopulationer.

SiC-seq eksperimentelle arbejdsproces indeholder 3 PDMS mikrofluid enheder fremstillet ved hjælp af en blød litografi procedure (figur 1). En co flow dropmaker (figur 3A) genererer 25 µm digital stregkode dråber for mærkning genomisk DNA med en unik én celle-id. Stregkode oligonukleotider består af en 15 bp degenererede sekvens flankeret af PCR håndtag til forstærkning (tabel 2, BAR primer). Stregkoder er fortyndet til en femtomolar koncentration at opnå enkelt-molekyle indkapsling, og alle dråberne modtage enten 0 eller 1 stregkode fragment(s). Dråber indeholdende en stregkode forstærkes, giver mange kopier af dobbelt-strenget stregkode amplikoner. En nukleinsyre pletten bruges til at kontrollere den succesfulde forstærkning og kvantificere indkapsling sats af stregkode fragmenter (figur 4B). Microgels er genereret af co flyder en bakteriel cellesuspension og en smeltet agarosegel på lige strømningshastigheder (figur 2A). Agarosen er parat på to gange den ønskede slutkoncentration, som co flow dropmaking proces effektivt udvander de vandige opløsninger med en faktor på 2. Da Agarosen køler, størkner det til en 25 µm diameter microgel besætter det sfæriske omfanget af denne droplet.
En række vask og lysis trin renser høj molekylvægt genomisk DNA i microgels (figur 2B). Efter at bryde emulsioner, foretages vandig skylninger i store mængder til fortyndes, trace organiske opløsningsmidler, som kan hæmme de downstream enzymatiske behandlinger. De vaskede microgels er observeret under et mikroskop for at kontrollere indkapsling cellehastighed (figur 4A). En cocktail af enzymer med bred lytisk aktivitet er tilføjet til microgel suspension til at fordøje cellevægge af bakterier og eukaryote mikrober19. En anden behandling med Proteinase K og vaskemiddel nedbryder proteinerne og solubilizes celle debris.
Tagmentation af oprenset DNA er udført i dråber til at undgå potentiel kontaminering som følge af diffusion af små tagmented DNA fragmenter mellem microgels18. En droplet indkapsling enhed (figur 3B) compartmentalizes hver microgel med en buffer og tagmentation enzym, som samtidig fragmenter dobbelt-strenget DNA mens også "kodning" det med en præinstalleret oligonukleotid20. Microgels er indlæst i dråber som tæt-pakket partikler, at opnå indkapsling satser nærmer sig 1 microgel for hver dråbe med få dubletter21 (figur 4 c).
I det sidste trin i arbejdsprocessen mikrofluid (figur 2 c) udfører en enhed en dobbelt fusion kombinerer 1 stregkode dråbe, 1 microgel-holdige dråbe og forstærkning mix i en kontrolleret totrinsproces. Først er et slipværktøj, som indeholder PCR reagens parret og fusioneret med en stregkode drop i regionen vist i gul (figur 5). Saltvand elektroder i mikrofluid kanalen producere en høj elektrisk felt gradient, som udløser en droplet fusion. I en lignende måde, er den første flettede droplet parret med en microgel dråbe og flettet en anden gang i regionen vist med rødt. Dråberne er indsamlet og termisk cyklede ud-chip i en enkelt-overlapning forlængelse (SOE) PCR. Overlappende supplerende enderne af stregkoden og tagmented genomisk DNA tillade fusion og eksponentiel forstærkning af kun korrekt barcoded konstruktioner.
Sequencing data er først filtreret efter et Læs kvalitet og derefter analyseres af gruppering læser efter deres 15-bp encellede stregkode sekvens. En stregkode gruppen kan anses for gyldigt, skal det indeholde et minimum antal læsninger; denne tærskel begrænser analysen til celler med en nyttig mængde sequencing data og fjerner PCR-muteret stregkoden "forældreløse" fra datasættet. I dette eksempel køre, minimum, der er indstillet til 7,5 kbps pr. gruppe (50 læsninger af 150 bp hver). Et histogram stregkode tæller versus Gruppestørrelse viser, at en betydelig del af grupperne gyldig stregkode er lige over tærskel størrelse (figur 6A).
I et kontrol-eksperiment hvor mikrobielle samfund sammensætning er kendt, bruges renhed og relativ overflod målinger til at vurdere kvaliteten af en SiC-seq køre. Her, er et syntetisk 10-celle fællesskab bestående af 3 gram-negative bakterier, 5 gram-positive bakterier og 2 gær analyseret. Renheden af en given stregkode gruppe er defineret som antallet af læser tilknytning til de mest almindelige genom i gruppen divideret med det samlede antal læsninger i gruppen. Det store flertal af grupperne stregkode er purities større end 0,95 (fig. 6B). Relativ overflod af celletyper beregnes ved at tælle de rå læsninger og ved at tælle stregkode grupper, hvor grupperne tildeles en celletype svarer til konsensus blandt dens medlemsstater læser (figur 6 c). Overfloden af læser og stregkode grupper spore i nogenlunde lige proportioner, der angiver, at cellepopulationer er at være udtaget prøver således, at visse arter ikke findes i uforholdsmæssig stor eller lille stregkode grupper. Plotte den samlede dækning af alle stregkode grupper fra en enkelt art angiver en høj dækning på tværs af det hele genom, med få eller ingen frafald regioner (figur 7). Ensartethed af dækning kan verificeres med en hyppighed distribution af normaliserede dækning værdier, med de fleste værdier centreret omkring gennemsnittet (figur 7, indsat).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figur 1 : Fremstilling af mikrofluid enheder af fotolitografi. (A) Master forme med en enkelt funktion højde er fremstillet af spin coating et lag af SU-8 photoresist på en silicium wafer. Photoresist er derefter mønstrede med en photolithographic maske og UV-lys, crosslinking den udsatte SU-8. Endelig, uncrosslinked SU-8 er opløst i en udvikler bad. Den resulterende skimmel bruges til at kaste PDMS, som er bundet til et glas dias til at producere den komplette mikrofluid enhed. ()B) For en dobbeltlags enhed, fabrikation ligeledes begynder med spin coating og eksponering trin. Disse trin gentages derefter oprette et tolags enhed. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figur 2: Oversigt over arbejdsprocessen SiC-seq. (A) A mikrobielle suspension er co flød med smeltet Agarosen i en dropmaker enhed til at indkapsle enkelt celler i microgels. (B) microgels udsættes for en serie af vasker til at rense den bakterielle genomisk DNA. Lytisk enzymer fordøje cellevægge af gram-positive bakterier og gær, og vaskemiddel solubilizes den celleaffald. Microgels er igen indkapslet i dråber for tagmentation at reducere krydskontaminering. (C) mikrofluid fusion kombinerer en digital PCR stregkode, en tagmented microgel genom og en forstærkning mix med en hastighed > 1 kHz. Off-chip SOE-PCR splices en unik encellede stregkode på tagmented genom og forstærker selektivt fuldt barcoded konstruktioner. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figur 3: Mikrofluid enheder til dropmaking og microgel re indkapsling. (A) dette panel viser en co flow dropmaker (25 µm af funktionen højde). Celler og smeltet Agarosen er indført i enheden ved lige strømningshastigheder at producere 25 µm dråber på en 25 µm x 25 µm junction. For digitale stregkode dropmaking, celle inlet er tilsluttet, og en PCR mix er indført i Agarosen indløb. (B) dette panel viser en microgel re indkapsling enhed (25 µm af funktionen højde). Microgels flyde ind i en tragtformet indgang til at opretholde deres tæt-pakket bestilling og modtage et volumen af tagmentation mix før re indkapsling i en 25 µm x 30 µm krydset. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figur 4 : Micrographs af dråber og microgels. (A) dette panel viser vasket 25 µm microgels før enzymatisk lysering. Bakterierne farves fluorescently til kvantificering af indkapsling satsen. Poisson lastning statistik diktere, at cellerne skal være indkapslet med en sats på 1: 10 dråber eller mindre at minimere hyppigheden af multiple-indkapsling begivenheder. (B) dette panel viser et Fluorescens mikroskopi billede af 25 µm digital stregkode dråber behandlet med en nukleinsyre pletten. Dråber indeholdende forstærket stregkode fragmenter producere en stærk fluorescens signal. (C) dette panel viser microgels re indkapslet i 50 µm dråber. Tæt-pakning af microgels giver mulighed for indkapsling satser nærmer sig 1 gel pr. drop med få dubletter. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figur 5 : Mikrofluid dobbelt fusion enhed for encellede genom stregkodesystem. En to-trins fusion par stregkode dråber med tagmented genomer på en høj overførselshastighed. En dråbe af PCR mix er først genereres og fusioneret med en stregkode droplet i regionen vist i gul ved hjælp af saltvand elektroder. Dernæst er et slipværktøj, som indeholder en microgel introduceret og flettet en anden gang i regionen vist med rødt. Olie fjorde giver mulighed for præcis styring af afstanden mellem de reinjected dråber. Stregkode reinjektion kammer og dens spacer olie er placeret på den kortere 25 µm lag, skyggefulde i blå. Alle andre enhedsfunktioner tilhører den tykkere lag med 45 µm af samlede højde. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figur 6 : Stregkode gruppe målinger for en 10-celle syntetiske mikrobielle samfund. (A) dette panel viser fordelingen af stregkoden gruppestørrelser. Antallet af grupper af en given størrelse falder eksponentielt som gruppe filstørrelsen øges. En minimumstærskel på 7,5 kbps pr. gruppe begrænser analysen til grupper med en tilstrækkelig mængde af information og fjerner PCR-muteret sekvens "forældreløse." (B) dette panel viser fordelingen af stregkode gruppe purities. Størstedelen (> 90%) af grupper er af meget høj renhed (> 95%). (C) dette panel viser den relative forekomst af 10 arter beregnet på koncernniveau Læs og stregkode. 2 tælle metoder giver lignende resultater, angiver, at barcode gruppestørrelser er konsistent på tværs af arter. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figur 7 : Samlet genomisk dækning af Bacillus subtilis stregkode grupper. Lyder fra alle stregkode grupper kortlægning at bakterien B. subtilis (N = 9,398) er samlet og analyseret i aggregat. Et cirkulært dækning kort illustrerer dækning ensartethed af SiC-seq læser, med ingen observerbare frafald regioner. En stiplet linje omkring omkredsen angiver den gennemsnitlige dækning (5,55 x). Inset histogrammet af relative dækning frekvenserne viser, at hovedparten af baserne er dækket på en dybde nær genome-wide gennemsnit, repræsenteret ved den stiplede linje. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enhed</td>
			<td>1. lag højde (µm)</td>
			<td>1. lag Spin hastighed (rpm)</td>
			<td>2. lag højde (µm)</td>
			<td>2. lag Spin hastighed (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Co flow dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>NIELSEN</td>
			<td>NIELSEN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gel re encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>NIELSEN</td>
			<td>NIELSEN</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dobbelt fusion</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: mikrofluid enhed fabrikation parametre. Denne tabel viser en liste over de mikrofluid enheder, der bruges i SiC-seq arbejdsprocessen med deres kræves hastigheder for photoresist spin coating (baseret på producentens specifikationer for SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etiket</td>
			<td colspan="5">Rækkefølge (5' > 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primer sekvenser.
Supplerende fil 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Encellede sekventering afslører genotypiske heterogenitet i biologiske systemer, men aktuelle teknologier mangler overførselshastighed noedvendigt for deep profilering af Fællesskabets sammensætning og funktion. Her, vi beskriver en mikrofluid arbejdsproces til sekvensering > 50.000 encellede genomer fra forskellige celle populationer.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikrofluid Platform for Måling neutrofilkemotaksi fra uforarbejdede fuldblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En Mikrofluid platform for langsigtet Multi-væv cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Ultra-lang Læs sekventering for hele genomisk DNA analyse

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...