Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation grâce à une bourse de carrière (numéro de licence DBI-1253293) ; le National Institutes of Health (NIH) (subvention nombres HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, le R01-HG008978) ; et le Defense Advanced Research projets Agence vivant fonderies Program (numéros de contrat HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

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Brevets se rapportant à ce flux de travail peuvent être autorisé à Mission Bio, de laquelle Adam R. Abate est actionnaire.

Le flux de travail microfluidique SiC-seq produit les données de séquençage du génome de la cellule unique parmi des milliers de cellules bactériennes. Codes à barres numériques épissés sur les génomes de cellules encapsulées microgel permettant la déconvolution de silico des données d’end en groupes de lectures avec code à barres, provenant de la même cellule. Une expérience de contrôle avec une communauté microbienne de composition connue, est nécessaire pour évaluer la pureté des groupes de codes à barres. Une grande partie des groupes de faible pureté indique que le taux d’encapsulation de cellules est trop élevé ou qu’il y a contamination croisée important gouttelette se produisant durant les étapes de traitement de la microfluidique. Selon les statistiques de Poisson, les codes-barres et les cellules doivent être isolés à un ratio de 1 particule pour chaque 10 gouttes à limiter le taux de plusieurs événements d’encapsulation à moins de 5 % de toutes les gouttelettes non vide. Un taux d’encapsulation au-dessus de celle-ci augmente les tarifs des doublets exponentiellement, donc la vérification du ratio encapsulation au cours du processus de dropmaking est d’une importance cruciale. Les utilisateurs doivent être particulièrement prudents de l’encapsulation des cellules multiples en un seul microgel parce que les lectures de différentes cellules partage la même séquence de code à barres ne peut pas être séparé de bioinformatically. Dans le cas que 1 cellule reçoit 2 différents codes à barres, la pureté de groupe de codes à barres n’est pas affectée même si les mesures d’abondance sont étalent lors du comptage par séquence de codes à barres.
Contamination croisée gouttelettes peut-être également survenir en raison des conditions sous-optimales fusion. Lors d’une opération réussie, le dispositif de fusion de microfluidique (Figure 5) pouvez contrôlable coupler 1 gouttelette de codes à barres avec 1 microgel et un volume de réactif PCR. Non-idéal débits seront traduira par une goutte d’appariement des ratios incorrect : 1 code à barres peut être couplé avec 2 microgels, par exemple. Tous les débits indiqués dans le protocole sont censés être des estimations et peuvent devoir être ajustée selon les légères variations dans les tailles de géométrie et de gouttelettes de dispositif. Les utilisateurs ayant accès aux caméras avec des capacités d’enregistrement à grande vitesse (> 10 000 images/s) devraient vérifier la fusion de gouttelettes correcte au début et au cours de l’opération de la microfluidique. Les utilisateurs n’ont pas accès à une caméra haute vitesse peuvent recueillir un petit volume de la sortie fusionnée et mesurer manuellement la taille des gouttelettes sous un microscope. La taille des gouttelettes devrait être uniforme : un excès de code à barres non fusionné ou gouttes microgel indique que le taux de réinjection devrait être réduite en conséquence.
Plusieurs générales devraient prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation microgels et projetées à préserver leur intégrité. MICROGELS, bien que mécaniquement robuste, il faut refroidir suffisamment avant la rupture et mesures pour s’assurer de gélification complete de lavage. Microgels non-spherical sont une indication que l’agarose n’était pas donné suffisamment de temps pour se solidifier. Lors du lavage microgels, tournez les suspensions en bas à la vitesse nécessaire pour éviter une perte de produit. D’agarose hydrogel a un indice de réfraction correspondant étroitement à celle de l’eau et peut-être être difficile à voir dans un tube22, donc les utilisateurs doivent bien identifier la limite gel-liquide avant l’aspiration. Gouttelettes d’eau dans l’huile sont sensibles à la coalescence de l’accumulation des forces statiques23 sur les tubes et les gants de laboratoire. Pour cette raison, nous vous recommandons de charger les seringues de réinjection de gouttelette à mains nues et de traiter toutes les lignes de réinjection avec un pistolet antistatique avant l’amorçage de la pompe. Grosses gouttelettes coalescentes peuvent être supprimées en tournant lentement les émulsions dans une seringue et en aspirant manuellement les gouttes plus grandes, qui s’accumulent près du sommet en raison de leur plus grande force de flottabilité.
SiC-seq est la première technologie de démontrer le séquençage du génome de cellules individuelles de > 50 000 cellules bactériennes. Cette plate-forme offre des avantages significatifs en matière de rapport aux approches existantes et permet un échantillonnage plus profond des communautés microbiennes hétérogènes. A ce jour, technologies microfluidiques pour le séquençage du génome de cellules individuelles ont employé microchambers micropuits et9 24 pour l’amplification et l’isolement cellulaire, mais avec des débits de l’ordre de seulement quelques dizaines à des centaines de cellules. Le flux tri des cellules uniques en wellplates5,6 ne nécessite aucune instrumentation de microfluidique spécialisés mais possède un débit de même faible. Étant donné que les échantillons de sol et l’eau de l’environnement ont généralement des diversités alpha de > 1 000 espèces de niveau25,26, SiC-seq est très avantageux en raison de sa capacité à déguster un bien plus grand nombre d’organismes. Le workflow de SiC-seq est adaptable aux entrées des cellules de culture en laboratoire, l’environnement naturel ou un hôte vivant. Un échantillon cellulaire doivent seulement être dans une suspension aqueuse et gratuits de grosses particules (> 10 µm) sont adaptés pour l’encapsulation de la microfluidique. Par exemple, la méthode a été appliquée auparavant à un échantillon d’eau de mer à l’aide d’une série de lavage et de filtrage des étapes pour pré-traiter les cellules avant encapsulation17.
Le protocole de SiC-seq génère une quantité relativement clairsemée de données de séquençage de chaque cellule unique et peut ne pas convenir pour toutes les applications. Certains algorithmes de bioinformatique comme assemblage de génome de novo ou variante de nucléotide (SNV) appelant nécessitent des profondeurs de couverture supérieurs à travailler efficacement. Au lieu de cela, des groupes de codes à barres peuvent être ordonné en clusters en silico par taxonomique binning méthodes27 afin que les algorithmes peuvent être appliqués sur les plus grands ensembles de lectures. L’efficacité de codage à barres globale relativement faible du workflow SiC-seq peut également présenter des défis dans les cas où la disponibilité de l’échantillon d’entrée est faible. SiC-seq s’appuie sur une étape d’encapsulation de barcode Poisson-distribué, donc environ 10 % des cellules reçoivent un code-barres moléculaire et sont amplifiés au cours de l’étape de préparation finale de bibliothèque. Tout cela est comparable aux autres régimes de barcoding axée sur les microgouttelettes10, utilisateurs qui travaillent avec des échantillons cellulaires précieux peuvent avoir des difficultés à atteindre le rendement de la bibliothèque adéquate pour le séquençage et devrez peut-être augmenter le nombre de cycles de la PCR en finale étape d’amplification. Une autre solution possible pour les utilisateurs connaissant bien microfluidique est de trier les gouttelettes de barcode positif après l’étape PCR numérique, ce qui porte l’efficacité globale des codes à barres à > 85 %28.
Une orientation future potentielle pour SiC-seq technologie s’adaptant le flux de travail pour une utilisation avec des cellules de mammifères, ouvrant la voie à nouvelles études cliniques de cellule unique. À titre d’exemple, une analyse de la variation numéro de copie entre cancer de simple cellules mai plus loin notre compréhension du rôle de l’hétérogénéité du cancer pathologie2. Alternativement, intégrant les méthodes existantes pour sonder et enrichir les séquences d’ADN d’intérêt29 de SiC-seq permettrait le séquençage unicellulaires ciblé des sous-populations ou rares souches de cellules. Avec des échantillons environnementaux, gènes de dans une voie métabolique connue pourraient être ciblés et analysés contextuellement aux côtés de voisins gènes afin d’identifier de nouveaux îlots génomiques. De dans un environnement hôte humain, des échantillons de bactéries pathogènes bas-titre a peuvent être isolés et séquencé au niveau cellule unique d’examiner de plus près leurs origines génotypiques de la virulence.

Le génome sert comme un modèle d’identité cellulaire et fonction, contenant l’intégralité d’un organisme de codification potentiel. Une compréhension de la biologie cellulaire au niveau du génome peut expliquer la diversité phénotypique observée au sein de populations de cellules hétérogènes. Cette hétérogénéité est apparente dans les systèmes biologiques et a de grandes implications pour la santé humaine et la maladie. Par exemple, gène copie numéros écarts entre les cellules tumorales sont liés à l’évolution et la propagation du cancer1,2. Dans les infections bactériennes, îles de pathogénicité présents dans une petite fraction des génomes horizontalement, peuvent être transférés et conduisent à la prolifération des bactéries résistantes aux antibiotiques3,4. Un défi principal dans l’étude des génomes au niveau unicellulaire est les faibles quantités d’ADN disponible, ainsi que la nécessité d’analyser des milliers de cellules à déguster toute la gamme des génotypes. Pour ces raisons, limitations de débit expérimental ont entravé l’efficacité des études unicellulaires, polarisation des résultats vers les cellules plus abondants. Techniques d’isolement de la cellule unique comme flux tri5,6, pinces optiques7, un enfoncement en vrac gels8et9 de la microfluidique sont capables de traiter des centaines de cellules pour le séquençage ; Toutefois, cela représente seulement une petite fraction de la plupart des échantillons. Une méthode pour le séquençage du génome de la cellule unique avec un débit nettement plus élevé permettrait plus profonde et plus complète de profilage de populations cellulaires, ainsi élucider le rôle de la diversité génotypique au sein de ces communautés.
Gouttelette microfluidique permet la manipulation de haut débit de cellules et de réactifs biologiques dans des millions de réacteurs picolitre. À ce jour, les microgouttelettes technologies ont été utilisées pour étudier l’expression différentielle entre les cellules de tissus hétérogènes10,11,12, profondément des séquences longues molécules13,14 ,15et conduite chromatine immunoprécipitation séquençage (ChiP-seq) analyses monocellules16. En effet, les gouttelettes sont capables d’opérations de haut-débit, compartimentées, ce qui les rend propices aux applications en génomique des cellules individuelles. Le développement de cette technologie présente ses propres défis technologiques uniques, cependant. Cellules doivent être lysées, purifiées et amplifiés avec polarisation minimale, à uniformément les populations de cellules échantillon. En outre, contrairement à polyadénylé transcriptions d’ARNm dans les cellules de mammifères, il n’y a aucun motif moléculaire comparable dans le génome pour faciliter la capture de l’acide nucléique cible. Pour ces raisons, le séquençage du génome de cellules individuelles a été difficile à mettre en œuvre dans les plates-formes de microgouttelettes.
Dans ce travail, nous fournissons un protocole détaillé de notre approche rapportées antérieurement unicellulaires microfluidique capable de séquencer les génomes de dizaines de milliers de cellules dans une seule expérience17. Avec cette technologie, appelée CTI-seq, cellules bactériennes sont encapsulés dans échelle micron hydrogels et individuellement lysées, tagmented et a fusionné avec un microdroplet contenant un code-barres unique oligonucléotide, qui est raccordé sur l’ADN génomique de la cellule via une chevauchement unique extension chaîne par polymérase (PCR). Les hydrogels servent de conteneurs isolés où l’ADN génomique de high-molecular-weight est stériquement enfermé, permettant à des molécules plus petites comme les détergents et enzymes lytiques d’accéder et de purifier l’ADN avant barcoding18. Ce protocole traite > 50 000 cellules uniques en quelques heures, ce qui entraîne une bibliothèque avec code à barres prête pour le séquençage. Après le séquençage, les lectures sont demultiplexed selon leur séquence de barcode unicellulaires, résultant en un ensemble de données composé de millions de lectures, chacun avec un indice de cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

Technologies de séquençage ont subi un changement de paradigme de vrac à cellule unique résolution faisant suite à une compréhension en évolution du rôle de l’hétérogénéité cellulaire dans les systèmes biologiques. Cependant, monocellulaires séquençage de vastes populations a été entravé par limites dans le traitement des génomes de séquençage. Dans cet article, nous décrivons une méthode de séquençage des génomes unicellulaires (SiC-seq) qui utilise des gouttelettes microfluidique à isoler, amplifier et code à barres des génomes de cellules individuelles. Encapsulation de cellules en microgels permet la purification compartimentée et tagmentation de l’ADN, alors qu’une fusion de microfluidique paires efficacement chaque génome avec un code à barres unique oligonucléotide unicellulaires, permettant à > 50 000 cellules individuelles à séquencer par course. Les données de séquençage sont démultiplexage par code à barres, générer des groupes de lectures provenant de cellules individuelles. Une méthode d’unicellulaires séquençage haut-débit et trop faible, SiC-seq afin de permettre à un plus large éventail d’études génomiques destiné aux populations de diverses cellules.

Le flux de travail expérimental de SiC-seq contient 3 Dispositifs microfluidiques PDMS fabriquées à l’aide d’une procédure de lithographie douce (Figure 1). Un flux de co dropmaker (Figure 3 a) génère 25 µm de gouttelettes de code-barres numérique pour le marquage de l’ADN génomique avec un identificateur unique de la cellule unique. Les oligonucléotides barcode consistent en une séquence dégénérée bp 15, flanqué de poignées PCR amplification (tableau 2, BAR amorce). Les codes à barres sont diluées à une concentration de femtomolar pour atteindre l’encapsulation de molécules simples, et toutes les gouttelettes recevoir des fragments de code à barres soit 0 ou 1. Les gouttelettes contenant un code à barres sont amplifiés, ce qui donne de nombreuses copies des amplicons barcode bicaténaire. Une tache d’acide nucléique est utilisée pour vérifier l’amplification réussie et de quantifier le taux d’encapsulation des fragments de code à barres (Figure 4 b). Les microgels sont générés par co coulant une suspension de cellules bactériennes et un gel d’agarose fondus à des débits égaux (Figure 2 a). L’agarose est prête à deux fois la concentration finale souhaitée, que le processus de dropmaking de flux co dilue efficacement les solutions aqueuses d’un facteur 2. L’agarose se refroidissant, elle se solidifie en une 25 µm de diamètre microgel occupant le volume sphérique de la goutte.
Une série d’étapes de lavage et lyse purifie l’ADN génomique de high-molecular-weight dans la microgels (Figure 2 b). Après la rupture de l’émulsion, lavages aqueux sont réalisées en grandes quantités pour diluer la trace des solvants organiques qui peuvent inhiber les traitements enzymatiques en aval. Les microgels lavés sont observés au microscope afin de vérifier le taux d’encapsulation de cellules (Figure 4 a). Un cocktail d’enzymes ayant une activité lytique large est ajouté à la suspension de microgel à digérer les parois cellulaires des bactéries et microbes eucaryotes19. Un second traitement avec la protéinase K et détergent dégrade les protéines et solubilise les débris cellulaires.
Tagmentation de l’ADN purifié est effectuée dans les gouttelettes pour éviter la contamination croisée potentielle résultant de la diffusion des fragments d’ADN de petits tagmented entre les microgels18. Un dispositif d’encapsulation de gouttelettes (Figure 3 b) compartimente chaque microgel avec une enzyme de tampon et tagmentation, qui en même temps des fragments ADN bicaténaire tout en également « tagging » avec un oligonucléotide préchargées20. Les microgels sont chargés dans les gouttelettes sous forme de particules compacte, encapsulation taux approchant 1 microgel pour chaque goutte avec quelques doublets21 (Figure 4).
Dans la dernière étape du flux de travail microfluidique (Figure 2), un appareil effectue une opération de double fusion combinant 1goutte de codes à barres et 1goutte microgel contenant le mélange d’amplification dans un processus en deux étapes contrôlées. Tout d’abord, une gouttelette contenant les réactifs PCR est jumelée et fusionnée avec une goutte de code-barres dans la région indiquée en jaune (Figure 5). Électrodes d’eau salée dans le canal microfluidique produisent un gradient de champ électrique élevé qui déclenche la fusion de gouttelettes. De manière similaire, la première goutte fusionnée est jumelée avec une gouttelette microgel et fusionnée une seconde fois dans la région en rouge. Les gouttelettes sont collectés et thermique vélo hors puce dans une extension simple chevauchement (SOE) PCR. Les extrémités complémentaires qui se chevauchent de la code à barres et l’ADN génomique de tagmented permettent de fusion et amplification exponentielle d’à bon droit les constructions avec code à barres.
Les données de séquençage sont d’abord filtrées par une qualité de lecture et puis analysées en groupant les lectures selon leur ordre de 15-bp unicellulaires barcode. Pour un groupe de codes à barres soit considérée valide, il doit contenir un nombre minimal de lectures ; ce seuil limite l’analyse aux cellules avec un volume utile de données de séquençage et supprime le code à barres muté PCR « orphelins » de l’objet dataset. Dans cet exemple est exécuté, le minimum est défini sur 7,5 KB/s par groupe (50 lectures de 150 bp chaque). Un histogramme des comtes code-barres par rapport à la taille du groupe montre qu’une partie importante des groupes de code à barres valide est juste au-dessus de la taille de seuil (Figure 6 a).
Dans une expérience de contrôle où la composition de la communauté microbienne est connue, la pureté et la métrique de l’abondance relative est utilisés pour évaluer la qualité d’un SiC-seq exécuter. Ici, une communauté de 10 éléments synthétique consistant en 3 bactéries Gram-négatives, 5 bactéries Gram-positives et 2 levures est analysée. La pureté d’un groupe donné de code à barres est définie comme le nombre de lectures de cartographie au génome plus courant dans le groupe divisé par le nombre total de lectures dans le groupe. La grande majorité des groupes de codes à barres ont des degrés de pureté supérieures à 0,95 (Figure 6 b). L’abondance relative des types de cellules est calculé en comptant les lectures brutes et en comptant les groupes de codes à barres, où les groupes reçoivent un type de cellule correspondant au consensus de ses lectures de membre (Figure 6). Suivi de l’abondance des lectures et des groupes de codes à barres dans des proportions à peu près égales, ce qui indique que les populations de cellules sont échantillonnées telle que certaines espèces ne sont pas contenus dans barcode anormalement petits ou grands groupes. Traçant la couverture globale de tous les groupes de codes à barres d’une seule espèce indique un taux de couverture élevé au sein du génome entier, avec peu ou pas les régions d’abandon (Figure 7). L’uniformité de la couverture peut être vérifiée avec une distribution de fréquence des valeurs normalisée de couverture, avec la plupart des valeurs centrées autour de la moyenne (Figure 7, encart).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figure 1 : Fabrication des dispositifs microfluidiques par photolithographie. (A) maître moules avec une hauteur de fonctionnalité unique sont fabriquées par spin enduit d’une couche de résine photosensible SU-8 sur une plaquette de silicium. La résine photosensible est modelée ensuite avec un masque photolithographique et les rayons UV, réticulation l’exposé SU-8. Enfin, non SU-8 est dissoute dans un bain de développeur. Le moule qui en résulte est utilisé pour effectuer un cast PDMS qui est collé sur une lame de verre pour produire du dispositif microfluidique complet. ()B) d’un dispositif de double-couche, la fabrication commence de la même façon avec mesures de revêtement et exposition de spin. Ces étapes sont répétées puis créer un dispositif de deux couches. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble du workflow SiC-seq. (A) A suspension microbienne est passée conjointement avec agarose fondu dans un dispositif dropmaker pour encapsuler des cellules individuelles en microgels. (B) les microgels sont soumis à une série de lavages pour purifier l’ADN génomique bactérienne. Des enzymes lytiques digèrent les parois cellulaires de levures et de bactéries Gram-positives et détergent solubilise les débris cellulaires. Les microgels sont re-encapsulés en gouttelettes pour la tagmentation de réduire la contamination croisée. (C), la fusion de la microfluidique combine un code-barres numérique de la PCR, un génome de microgel tagmented et un mélange d’amplification à un taux > 1 kHz. Hors puce SOE-PCR épissures un code-barres unique d’unicellulaires sur le génome de tagmented et sélectivement amplifie entièrement construit avec code à barres. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figure 3 : Dispositifs microfluidiques pour Re-l’encapsulation de dropmaking et microgel. (A), ce panneau indique un écoulement co dropmaker (25 µm de hauteur de l’élément). Cellules et fondu agarose sont introduits dans l’appareil à des débits égaux pour produire 25 µm gouttelettes à la jonction de µm 25 µm x 25. Pour le dropmaking de code-barres numérique, l’entrée de la cellule est branchée, et un mélange PCR est introduit dans l’entrée d’agarose. (B), ce panneau montre un dispositif de Re-encapsulation microgel (25 µm de hauteur de l’élément). Les microgels se jettent dans une baie en forme d’entonnoir pour maintenir leur commande compacte et recevoir un volume de tagmentation mélange avant la Re-encapsulation à un carrefour de µm de 25 µm x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figure 4 : Micrographies de gouttelettes et microgels. (A), ce panneau affiche lavé 25 µm microgels avant lyse enzymatique. Les bactéries sont colorées fluorescent pour la quantification du taux d’encapsulation. Statistiques de chargement de poisson exigent que les cellules puisse être encapsulé à raison de 1 à 10 gouttes ou moins pour réduire la fréquence des événements multiples-encapsulation. (B) ce panneau montre une image de microscopie de fluorescence de 25 µm code-barres numérique gouttelettes traités avec une tache d’acide nucléique. Les gouttelettes contenant des fragments amplifiés barcode produisent un signal de fluorescence forte. (C) ce panneau montre microgels re-encapsulé dans 50 µm gouttes. La clôture-emballage de la microgels permet des taux d’encapsulation approchant 1 gel par goutte d’eau avec quelques doublets. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figure 5 : Dispositif de double fusion microfluidique de génome de la cellule unique barcoding. Une opération de fusion en deux étapes des paires des gouttelettes de code-barres avec les génomes de tagmented à un haut débit. Une goutte de mélange PCR est d’abord générée et fusionnée avec une goutte de codes à barres sur la région indiquée en jaune à l’aide d’électrodes de l’eau salées. Ensuite, une gouttelette contenant une microgel est introduite et fusionnée une seconde fois dans la région en rouge. Prises d’huile permettent un contrôle précis de l’espacement entre les gouttelettes réinjectées. La chambre de réinjection de codes à barres et son huile d’espacement sont placés sur la couche plus courte de 25 µm, ombragée en bleu. Toutes les autres fonctionnalités de l’appareil appartenant à la couche plus épaisse avec 45 µm de hauteur totale. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figure 6 : Mesures de groupe de codes à barres pour une communauté microbienne synthétique de 10 cellules. (A), ce panneau montre la distribution du code barre taille des groupes. Le nombre de groupes d’une taille donnée diminue exponentiellement avec l’augmentation de taille de groupe. Un seuil minimum de 7,5 KB/s par groupe restreint l’analyse aux groupes avec une quantité suffisante de renseignements et supprime la séquence muté PCR « orphelins ». (B), ce panneau montre la répartition des codes à barres puretés de groupe. La grande majorité (> 90 %) des groupes sont de très haute pureté (> 95 %). (C) ce panneau montre l’abondance relative des 10 espèces calculé au niveau du groupe lecture et code à barres. Les 2 méthodes de comptage donnent des résultats similaires, indiquant que les tailles de groupe de codes à barres sont conformes à toutes les espèces. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figure 7 : Agréger génomique couverture de Bacillus subtilis des groupes de codes à barres. Les lectures de tous les groupes de codes à barres, cartographie pour la bactérie b. subtilis (N = 9 398) sont regroupées et analysées dans leur ensemble. Une carte de couverture circulaire illustre l’uniformité de la couverture de la SiC-seq dispose, avec aucune région d’abandon observables. Une ligne pointillée autour de la circonférence indique la couverture moyenne (5,55 x). L’histogramme de l’encart des fréquences couverture relative montre qu’une grande partie de la base sont couverts à une profondeur près de la moyenne pour l’ensemble du génome, représentée par la ligne pointillée. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Appareil</td>
			<td>1ère couche hauteur (µm)</td>
			<td>1ère couche vitesse d’essorage (tr/min)</td>
			<td>2ème couche hauteur (µm)</td>
			<td>2ème couche vitesse d’essorage (tr/min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flux de co dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Re-encapsuleur gel</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Double fusion</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : paramètres de fabrication de dispositif microfluidique. Ce tableau présente la liste des dispositifs microfluidiques utilisés dans le workflow de SiC-seq avec leurs vitesses requises pour photorésine spin coating (basé sur les spécifications du fabricant pour 3025 SU-8).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étiquette</td>
			<td colspan="5">Séquence (5' > 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Séquences d’amorce.
Fichier supplémentaire 1 : <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

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Unicellulaire séquençage révèle une hétérogénéité génotypique dans les systèmes biologiques, mais les technologies actuelles n’ont pas le débit nécessaire pour la détermination des caractéristiques profondes de la fonction et la composition de la communauté. Nous décrivons ici un "workflow" microfluidique pour séquençage > 50 000 unicellulaires génomes de diverses populations de cellules.

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Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Une plate-forme microfluidique pour l&#39;isolement à haut débit unique cellule et Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Séquençage de l’ultra longue lecture pour l’analyse de l’ADN génomique ensemble

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...