Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gjennom en CAREER-pris (bevilgning nummer DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (grant tall HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); og Defense Advanced prosjekter byrå bor støperier forskningsprogrammet (kontrakt nummer HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol>
	<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients.">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li><li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+islands+in+bacterial+pathogenesis.">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li><li>Mart&#237;nez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection:+pathogenicity+epidemicity,+and+antibiotic+resistance.">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+for+single+cells.">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li><li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing.">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics.">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+labeling+(Hi-SCL)+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics.">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li><li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing.">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing.">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784 (2016).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding.">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li><li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions.">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li><li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota.">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li><li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering.">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).</li><li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics.">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).</li><li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun.">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment.">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).</li><li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes.">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li><li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+metagenomic+sequences:+methods+and+challenges.">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing.">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).</li><li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+helix+in+a+haystack:+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics.">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li></ol>

Patenter vedrørende denne arbeidsflyten kan være er lisensiert til oppdraget Bio, av hvilke Adam R. Abate en aksjonær.

SiC-seq microfluidic arbeidsflyten produserer encellede genom sekvensering data fra tusenvis av bakterielle celler. Digital strekkoder skjøtes på genomer mikrogel-innkapslet celler tillate i sili deconvolution NGS data i grupper av barcoded stammer fra samme celle. En kontroll eksperimentere med et mikrobielle samfunn av kjente komposisjon er nødvendig for å vurdere renheten av strekkoden gruppene. En stor andel av lav-renhet grupper angir at celle innkapsling frekvensen er for høy eller at det er betydelig slippverktøy kryss-kontaminering oppstår under microfluidic behandlingstrinnene. Ifølge Poisson bør de strekkoder og være innkapslet i målet forholdet 1 partikkel for hver 10 dråper begrense frekvensen av flere innkapsling hendelser mindre enn 5% av alle ikke-tom dråper. En innkapsling hastighet høyere enn dette øker satsene for doublets eksponentielt, så verifisering av innkapsling forhold under dropmaking prosessen er av avgjørende betydning. Brukere bør være spesielt forsiktig med innkapsling av flere celler i en enkelt mikrogel fordi leseoperasjoner fra forskjellige celler deler samme strekkode sekvens ikke kan være bioinformatically atskilt. I tilfelle 1 cellen mottar 2 forskjellige strekkoder, strekkode gruppe renhet er upåvirket selv om overflod beregningene er skjev ved telling av strekkoden sekvens.
Slippverktøy kryssforurensning kan også oppstå på grunn av suboptimal fusjonen. Under en vellykket operasjon, kan microfluidic fusjonen enheten (figur 5) controllably koble 1 strekkode dråpestørrelse med 1 mikrogel og en mengde PCR reagens. Ikke-ideelle strømningshastigheter vil resultere i en dråpe sammenkobling på feil forholdstall: 1 strekkode kan være forbundet med 2 microgels, for eksempel. Alle flyt priser oppført i protokollen er ment å være estimater og må justeres avhengig av små variasjoner i enheten geometri og slippverktøy størrelser. Brukere med tilgang til kameraer med høyhastighets-opptak evner (> 10 000 bilder/s) bør kontrollere riktig slippverktøy fusjonen i begynnelsen og i løpet av microfluidic operasjonen. Brukere uten tilgang til et høyhastighets kamera kan samle en liten mengde flettede utdata og manuelt måle slippverktøy størrelser under et mikroskop. Dråpestørrelse bør være ensartet: et overskudd av uflettede strekkoder eller mikrogel drops angir at reinjeksjon prisene skal reduseres tilsvarende.
Flere generelle forholdsregler bør tas ved håndtering av microgels og microdroplets å bevare sin integritet. Microgels, må om mekanisk robust, være tilstrekkelig avkjølt før bryte og vaske trinn for å sikre fullstendig gelation. Non-sfærisk microgels er en indikasjon at agarose ikke var gitt tilstrekkelig tid til å stivne. Når du vasker microgels Nedspinning av suspensjon av nødvendig hastighet å unngå tap av produktet. Agarose hydrogel har en brytningsindeks stemmer godt overens med vann og kan være vanskelig å se i en tube22, så brukerne bør nøye identifisere gel-flytende grensen før aspirasjon. Vann-i-olje dråper er mottakelige for Koalesens av oppbyggingen av statisk styrker23 på laboratoriet hansker og rør. Derfor anbefaler vi lasting slippverktøy reinjeksjon sprøyter med nakne hender og behandle alle reinjeksjon linjene med en antistatisk pistol før pumpen grunning. Store coalesced dråper kan fjernes ved sakte roterende emulgatorer i en sprøyte og manuelt aspirating større dråper, som akkumulerer øverst på grunn av deres større høy styrke.
SiC-seq er den første teknologien å demonstrere encellede genomet sekvensering av > 50.000 bakterielle celler. Denne plattformen tilbyr betydelige fordeler i gjennomstrømming over eksisterende tilnærminger og gir et dypere utvalg av heterogene mikrobielle samfunn. Hittil har microfluidic teknologier for enkeltceller genomet sekvensering ansatt microchambers9 og microwells24 for cellen aisolering og forsterkning, men med stykklistenøyaktighet i området bare titalls til hundrevis av celler. Flyt sorteringen av enkeltceller i wellplates5,6 krever ingen spesialisert microfluidic instrumentering men har tilsvarende lav overføringshastighet. Gitt at jord og vann prøver fra miljøet har vanligvis alfa forskjeller i > 1000 på arten nivå25,26, SiC-seq er svært fordelaktig i kraft av sin evne til å smake et langt større antall organismer. SiC-seq arbeidsflyten er tilpasningsdyktig til celle innganger laboratorium kulturen, naturen eller et levende vert. En celle prøve trenger bare være i en vandig suspensjon og uten store partikler (> 10 µm) å være egnet for microfluidic innkapsling. For eksempel er metoden tidligere brukt et utvalg av sjøvann ved hjelp av en rekke vask og filtrering for å forhåndsbehandle cellene før innkapsling17.
SiC-seq protokollen genererer en relativt sparsom mengde sekvensering data fra hver enkelt celle og kan ikke være egnet for alle programmer. Noen bioinformatikk algoritmer som de novo genomet montering eller single nukleotid variant (SNV) ringer krever høyere dekning dypet å arbeide effektivt. I stedet kan strekkode grupper være gruppert i sili av taksonomisk binning metoder27 slik at algoritmer kan brukes på større sett leser. Relativt lav barcoding virkningsgraden i SiC-seq arbeidsflyten kan også presentere utfordringer i tilfeller der tilgjengeligheten av inn prøven er lav. SiC-seq avhenger litt Poisson-distribuert strekkode innkapsling, derfor ca 10% av cellene mottar en molekylær strekkode og er forsterket i løpet av det siste bibliotek forberedelse skrittet. Mens dette kan sammenlignes med andre microdroplet-baserte barcoding ordninger10, brukere som arbeider med dyrebare celle prøver kan ha problemer med å oppnå tilstrekkelig biblioteket avkastningen for sekvensering og må øke antall PCR sykluser i finalen forsterkning trinn. En annen mulig løsning for brukernes med microfluidic kompetanse er å sortere positiv strekkode dråper etter digital PCR trinn, dermed å barcoding virkningsgraden > 85%28.
En potensiell fremtidig retning for SiC-seq teknologi er tilpasse arbeidsflyten for bruk med pattedyrceller, banet vei for nye kliniske encellede studier. Som et eksempel, en analyse av kopi nummer variasjon blant enkelt kreft celler kan ytterligere vår forståelse av rollen av heterogenitet i kreft patologi2. Også ville integrere SiC-seq eksisterende metoder for å undersøke og berike DNA-sekvenser av interesse29 aktivere den målrettede encellede sekvensering av subpopulasjoner eller sjeldne stammer av celler. Med miljøprøver, kan gener fra i en kjent stoffskiftebane være målrettet og analysert innholdsrettede sammen med nabokommunene gener for å identifisere romanen genomic øyene. Fra innenfor et menneske vert miljø, lav-titer patogene bakterier prøver kan isoleres og sekvensielt på encellede nivå undersøke mer tett deres genotypic opprinnelsen til virulens.

Genomet fungerer som en blåkopi av mobilnettet identitet og funksjonen, som inneholder helheten av en organisme er koding potensial. En forståelse av mobilnettet biologi på genomet nivå kan forklare observerte fenotypiske mangfoldet i ulike celle populasjoner. Denne heterogene i biologiske systemer og har brede implikasjoner for helse og sykdom. For eksempel er genet kopi nummer variasjoner blant kreftceller knyttet til utvikling og spredning av kreft1,2. Bakterielle infeksjoner, virusets øyene i en brøkdel av genomer kan overføres horisontalt og fører til spredning av antibiotika-resistente bakterier3,4. En primær utfordring studere genomer på encellede nivå er lavt antall DNA tilgjengelig, samt behovet for å analysere tusenvis av celler for å prøve hele mangfoldet av genotyper. For disse grunner, har begrensninger i eksperimentell gjennomstrømming hindret effektiviteten av encellede studier, biasing resultatene mot de rikeste cellene. Encellede isolasjon teknikker som flyt sortering5,6, optisk pinsett7, forankring i bulk gels8og microfluidics9 kan der hundrevis av celler for sekvensering; men er dette bare en liten brøkdel av de fleste prøver. En metode for enkeltceller genomet sekvensering med betydelig høyere gjennomstrømming ville tillate dypere og mer komplett profilering av celle populasjoner, og dermed Klargjørende rollen genotypic mangfold innenfor disse samfunnene.
Slippverktøy microfluidics gir høy gjennomstrømming manipulering av celler og biologiske reagenser i millioner av picoliter skala reaktorer. Hittil har microdroplet technologies har blitt brukt til å studere differensial uttrykk mønstre blant celler fra heterogen vev10,11,12, dypt sekvens lang molekyler13,14 ,15, og gjennomføre chromatin immunoprecipitation sekvenser (ChiP-seq) analyser på enkeltceller16. Faktisk er microdroplets i stand til høy gjennomstrømning og compartmentalized operasjoner, gjøre dem mottakelig for programmer i én celle genomics. Utviklingen av denne teknologien presenterer sin egen unike teknologiske utfordringer, imidlertid. Cellene må være lysed, renset, og forsterket med minimal skjevhet, jevnt utvalg celle populasjoner. I motsetning til polyadenylated mRNA transkripsjoner i pattedyrceller er det ingen sammenlignbare molekylær motiv i genomet til rette erobringen av nukleinsyre mål. For disse grunner, har encellede genomet sekvensering vært vanskelig å gjennomføre microdroplet plattformer.
I dette arbeidet gir vi en detaljert protokoll i vår tidligere rapportert encellede microfluidic tilnærming kan sekvensering genomer titusenvis av celler i en enkelt eksperiment17. Med denne teknologien, kalt SiC-seq, bakterielle celler er innkapslet i mikron skala hydrogels og individuelt lysed, tagmented, og sammen med en microdroplet som inneholder en unik oligonucleotide strekkode, som er skjøtes på cellens genomisk DNA via en enkelt overlapping forlengelsen polymerasekjedereaksjons (PCR). Hydrogels tjene som isolert beholdere som høy-molekylvekt genomisk DNA sterically sitter, slik at mindre molekyler som vaskemidler og lytisk enzymer tilgang og rense før barcoding18. Denne protokollen behandler > 50.000 enkeltceller i løpet av timer, noe som resulterer i et barcoded bibliotek klar for sekvenser. Etter sekvensering er lest demultiplexed i henhold til deres encellede strekkode sekvensen, som resulterer i et dataset består av millioner av lyder, hver med en mobilnettet indeks.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

Sekvensering teknologi har gjennomgått et paradigmeskifte fra bulk encellede oppløsning svar til en økende forståelse av rollen av mobilnettet heterogenitet i biologiske systemer. Imidlertid vært encellede sekvensering av store befolkningsgrupper hemmet av begrensninger i behandlingen genomer for sekvenser. I dette papiret beskriver vi en metode for enkeltceller genomet sekvensering (SiC-seq) som bruker dråpe microfluidics å isolere, forsterke og strekkode genomer i enkeltceller. Celle-innkapsling i microgels tillater compartmentalized rensing og tagmentation av DNA, mens microfluidic sammenslåing effektivt par hver genomet med en unik encellede oligonucleotide strekkode, slik at > 50.000 enkeltceller som ble sekvensert per kjørt. Sekvensering dataene er demultiplexed av strekkode, generere grupper av lyder fra enkeltceller. Som en høy gjennomstrømming og lav-bias encellede sekvensering gir SiC-seq et bredere spekter av genomisk studier rettet mot ulike celle populasjoner.

SiC-seq eksperimentelle arbeidsflyten inneholder 3 PDMS microfluidic enheter fabrikasjon benytter en myk litografi prosedyre (figur 1). En co flyt dropmaker (figur 3A) genererer 25 µm til digital strekkode dråper for merking genomisk DNA med en unik ID, én celle. Strekkode-oligonucleotides består av en 15 bp degenerert sekvens flankert av PCR håndtak for forsterkning (tabell 2, BAR primer). Strekkodene er utvannet til en femtomolar konsentrasjon å oppnå enkelt-molekylet innkapsling, og alle dråper motta enten 0 eller 1 strekkode fragment(s). Dråpestørrelse inneholder en strekkode er forsterket, gir mange eksemplarer av double-strandet strekkode amplicons. En nukleinsyre flekk brukes til å bekrefte vellykket forsterkning og kvantifisere innkapsling frekvensen av strekkoden fragmenter (figur 4B). Microgels genereres av co flyter en bakteriell celle suspensjon og en smeltet agarose gel lik strømningshastigheter (figur 2A). Agarose er forberedt på to ganger ønsket endelige konsentrasjonen, som co flyt dropmaking prosessen effektivt utvanner de vandige løsningene med en faktor på 2. Som agarose kjøler, størkner det i en 25 µm diameter mikrogel opptar sfærisk volumet av slippverktøyet.
En rekke vask og lyseringsbufferen trinn renser høy-molekylvekt genomisk DNA i microgels (figur 2B). Etter å ha brutt emulgatorer, utføres vandig vasker i store mengder for å fortynne ut spor organiske løsemidler som kan hemme nedstrøms enzymatisk behandlinger. De vasket microgels er observert under et mikroskop kontrollere innkapsling cellehastighet (figur 4A). En cocktail av enzymer med bred lytisk aktivitet legges til mikrogel suspensjon å fordøye cellen vegger av bakterier og eukaryotic mikrober19. En andre behandling med proteinasen K og vaskemiddel forringer proteiner og solubilizes celle rusk.
Tagmentation av renset DNA utføres i dråper å unngå potensielle kryssforurensning skyldes spredningen av små tagmented DNA fragmenter mellom microgels18. En dråpe innkapsling enhet (figur 3B) compartmentalizes hver mikrogel med en buffer og tagmentation enzym, som samtidig fragmenter double-strandet DNA mens også "merking" det med en forhåndsinstallert oligonucleotide20. Microgels er lastet inn dråpene som tett-pakket partikler, oppnå innkapsling priser nærmer seg 1 mikrogel for hver dråpe med noen doublets21 (figur 4C).
I siste trinn i microfluidic arbeidsflyten (figur 2C) utfører en enhet en dobbel fusjonen operasjon kombinerer 1 strekkode dråpe, 1 mikrogel inneholder drop og forsterkning blandingen i en kontrollert prosess. Først er et slippverktøy som inneholder PCR reagens tilkoblet og slått sammen med en strekkode nedgang i regionen vises i gule (figur 5). Saltvann elektrodene i mikrovæskekanalen produsere høy elektrisk felt gradering som utløser slippverktøy fusjonen. På en lignende måte, er første flettede slippverktøyet sammen med et mikrogel slippverktøy og slått sammen en gang i regionen vises i rødt. Dråpene er samlet og termisk syklet av sjetonger i en enkelt-overlapping utvidelse (SOE) PCR. De overlappende komplementære endene av strekkoden og tagmented genomisk DNA tillate fusion og eksponentiell forsterkning av bare riktig barcoded konstruksjoner.
Sekvensering dataene først filtrert av en Les kvalitet og deretter analyseres av gruppering leser etter den 15-bp encellede strekkode-sekvensen. For en strekkode gruppe skal være gyldig, bør den inneholde et minimum antall leser; Denne terskelverdi begrenser analyse til celler med en nyttig datamengde sekvensering og fjerner PCR-mutert strekkoden "foreldreløse" fra datasettet. Dette eksemplet kjører minimum er satt til 7,5 kbps per gruppe (50 leser av 150 bp hver). Et histogram strekkode som teller mot gruppestørrelsen viser at en betydelig del av gyldig strekkode gruppene er like over terskelstørrelsen (figur 6A).
I en kontroll eksperiment der mikrobielle samfunn sammensetningen er kjent, brukes renhet og relative overflod beregninger til å vurdere kvaliteten på en SiC-seq kjøre. Her, er en syntetisk 10-celle fellesskap bestående av 3 gram-negative bakterier, 5 gram-positive bakteriene og 2 gjær analysert. Renheten av en gitt strekkode-gruppe defineres som antall leser tilordning til vanligste genomet i gruppen delt på totalt antall lesninger i gruppen. De aller fleste av strekkoden grupper har purities større enn 0,95 (figur 6B). Relative overflod celletyper beregnes ved å telle den rå lest og ved å telle strekkode grupper, hvor gruppene tilordnes en celle type svarer til konsensus av sin medlem (figur 6C). Overflod av leser og strekkode grupper spor i omtrent like forhold, som angir at celle populasjoner som samples slik at enkelte arter ikke finnes i strekkode for uforholdsmessig små eller store grupper. Plotting samlet dekning av alle strekkode grupper fra én art angir en høy dekning over hele genomet, med få eller ingen frafall områder (figur 7). Sıtt dekning kan bekreftes med en frekvens distribusjon av normalisert dekning verdier, med de fleste verdier sentrert rundt gjennomsnittet (figur 7innfelt).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figur 1 : Fabrikasjon av microfluidic enheter av klima og jordsmonn. (A) Master formene med en enkel funksjon høyde er fabrikkert av spin belegg et lag av SU-8 photoresist på en silicon wafer. Photoresist er deretter mønstret med photolithographic maske og UV-lys, crosslinking eksponert SU-8. Endelig oppløses uncrosslinked SU-8 i en utvikler bad. Resulterende mold brukes å kaste PDMS som er limt til et glass lysbilde å produsere komplett microfluidic enheten. (B) For tolags utstyr fabrikasjon tilsvarende begynner med spin belegg og eksponering trinn. Disse trinnene er så gjentok opprette en to-lags enhet. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figur 2: Oversikt over SiC-seq arbeidsflyten. (A) A mikrobiell suspensjon er co strømmet med smeltet agarose i en dropmaker enhet å kapsle enkeltceller i microgels. (B) i microgels er utsatt for en rekke vasker å rense bakteriell genomisk DNA. Lytisk enzymer fordøye cellen vegger av gram-positive bakterier og gjær og vaskemiddel solubilizes mobilnettet rusk. Microgels er nytt innkapslet i dråper for tagmentation å redusere kryssforurensning. (C) microfluidic fusjonen kombinerer en digital PCR-strekkode, en tagmented mikrogel genomet og en forsterkning blanding med en hastighet > 1 kHz. Av-chip SOE PCR splint en unik encellede strekkode på tagmented genomet og forsterker selektivt fullt barcoded konstruksjoner. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figur 3: Microfluidic enheter for dropmaking og mikrogel re innkapsling. (A) dette panelet viser en co flyt dropmaker (25 µm funksjonen høyde). Celler og smeltet agarose blir introdusert inn i apparat på likt strømningshastigheter å produsere 25 µm dråper på en 25 µm x 25 µm junction. Digital strekkode-dropmaking celle mengden er koblet og en PCR blanding er introdusert i agarose mengden. (B) dette panelet viser en mikrogel re innkapsling enhet (25 µm funksjonen høyde). Microgels flyte inn i en trakt-formede vik å opprettholde deres tett-pakket bestiller og mottar en tagmentation blanding før re innkapsling på en 25 µm x 30 µm junction. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figur 4 : Micrographs dråper og microgels. (A) dette panelet viser vasket 25 µm microgels før enzymatisk lysis. Bakterier er fluorescently farget for kvantifisering av innkapsling rate. Poisson lasting statistikken tilsier at cellene skal være innkapslet med en hastighet på 1 av 10 dråper eller mindre å redusere frekvensen av flere-innkapsling hendelser. (B) dette panelet viser et fluorescens mikroskopi bilde av 25 µm digital strekkode dråper behandlet med en nukleinsyre flekk. Dråpestørrelse inneholder forsterket strekkode fragmenter produserer en sterk fluorescens signal. (C) dette panelet viser microgels re innkapslet i 50 µm drops. Lukk-pakking av microgels muliggjør innkapsling priser nærmer seg 1 gel per slipp med noen doublets. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figur 5 : Microfluidic dobbel fusjonen enhet for enkeltceller genomet barcoding. En to-trinns fusjonen operasjon parene strekkode dråper med tagmented genomer på en høy gjennomstrømming. En dråpe PCR blanding første genereres og slått sammen med en strekkode dråpe i regionen vises i gule med saltvann elektroder. Deretter er et slippverktøy som inneholder en mikrogel innført og slått sammen en gang i regionen vises i rødt. Olje viker tillater presis kontroll av avstanden mellom reinjisert dråpene. Strekkode reinjeksjon kammeret og spacer olje er plassert på kortere 25 µm laget, skyggelagt med blått. Alle andre enhetsfunksjoner tilhører tykkere laget med 45 µm total høyde. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figur 6 : Strekkode gruppe beregninger for en 10-celle syntetiske mikrobielle samfunn. (A) dette panelet viser fordelingen av strekkoden gruppe størrelser. Antall grupper i en gitt størrelse reduseres eksponentielt som gruppe størrelse øker. En laveste terskelen på 7,5 kbps per gruppe begrenser analyse til grupper med en tilstrekkelig mengde informasjon og fjerner PCR-mutert sekvensen "foreldreløse". (B) dette panelet viser fordelingen av strekkoden gruppe purities. De aller fleste (> 90%) av grupper er svært høy renhetsgrad (> 95%). (C) dette panelet viser den relative overfloden av 10 arter beregnet på gruppenivå lese og strekkode. 2 teller metoder gir samme resultat, indikerer at strekkoden gruppe størrelsene er konsekvent på tvers av arter. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figur 7 : Samlet genomisk dekning av Bacillus subtilis Strekkode grupper. Lest fra alle strekkode gruppene tilordning til bakterien B. subtilis (N = 9,398) er samlet og analysert samlet. En sirkulær dekningskart illustrerer dekning sıtt SiC-seq-leser, med ingen observerbare dropout regioner. En stiplet linje rundt omkretsen angir gjennomsnittlig dekning (5.55 x). Innfelt histogrammet av relativ dekning frekvenser viser at hoveddelen av baser er dekket dyp nær genomet hele gjennomsnittet, representert ved den stiplede linjen. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enheten</td>
			<td>1 lag høyde (µm)</td>
			<td>1 lag Spin hastighet (rpm)</td>
			<td>2 lag høyde (µm)</td>
			<td>2 lag Spin hastighet (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Co flyt dropmaker</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>I/T</td>
			<td>I/T</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gel re encapsulator</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>I/T</td>
			<td>I/T</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dobbel fusjon</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Microfluidic enhetsparametrene fabrikasjon. Denne tabellen viser en liste over microfluidic-enheter brukes SiC-seq arbeidsflyten med deres nødvendig hastigheter for photoresist spinn belegg (basert på produsentens spesifikasjoner for SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etikett</td>
			<td colspan="5">Sekvens (5' > 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primer sekvenser.
Ekstra fil 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Ekstra filen 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En av beryllium gjennomstrømming Microfluidic plattform for enkeltceller genomet sekvensering

Encellede sekvensering avslører genotypic heterogenitet i biologiske systemer, men dagens teknologi mangler gjennomstrømningen nødvendig for dyp profilering av samfunnet komposisjon og funksjon. Her beskriver vi en microfluidic arbeidsflyt for sekvensering > 50.000 encellede genomer fra ulike celle populasjoner.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter bioreaktor for Microbial Encellede Analyse: Fabrikasjon, System Setup, og drift

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Microfluidic plattform for måling Neutrofil Chemotaxis fra Ubehandlet Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En mikrofluid plattform for langsiktig Multi-vev coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Svært lang lese sekvenser for hele genomisk DNA-analyse

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...