Name: an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

Эта работа была поддержана национального научного фонда через CAREER Award (номер гранта DBI-1253293); Национальные институты здравоохранения (NIH) (Грант № HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); и обороны передовых исследовательских проектов Агентства живущих литейные программа (номера контрактов, Номера HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

<ol>
	<li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients.">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li><li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+islands+in+bacterial+pathogenesis.">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li><li>Mart&#237;nez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection:+pathogenicity+epidemicity,+and+antibiotic+resistance.">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics.">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li><li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+for+single+cells.">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li><li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing.">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics.">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+labeling+(Hi-SCL)+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics.">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li><li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing.">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li><li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing.">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li><li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing.">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784 (2016).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding.">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li><li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions.">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li><li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota.">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li><li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering.">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).</li><li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics.">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).</li><li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun.">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li><li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells.">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li><li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment.">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).</li><li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes.">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li><li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+metagenomic+sequences:+methods+and+challenges.">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing.">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).</li><li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+helix+in+a+haystack:+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics.">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li></ol>

Патентов, относящихся к этот рабочий процесс может быть лицензированы для био миссии, из которой Abate р. Адам является акционером.

SiC-seq microfluidic процесс производит одноклеточных геном последовательности данных из тысяч бактериальных клеток. Цифровая штрих, сращивания на геномы microgel инкапсулированные клетки позволяют в silico деконволюция NGS данных в группы гласит перепутываются, происходящих из той же клетке. Управления эксперимент с микробной сообщества известные композиции является необходимым для оценки чистоты штрих-кодов групп. Значительная часть групп низкой чистоты указывает, что ячейки инкапсуляции скорость слишком высока или что существует значительный капелька перекрестное загрязнение происходящих во время обработки microfluidic шаги. Согласно статистике Пуассона штрих-кодов и клетки должны инкапсулироваться в целевой соотношении 1 частиц на каждые 10 капель ограничить скорость несколько инкапсуляции событий до менее чем 5% всех непустых капель. Инкапсуляция ставки выше, чем это увеличивает ставки Дуплеты экспоненциально, поэтому проверка коэффициента инкапсуляции во время процесса dropmaking имеет решающее значение. Пользователи должны быть особенно осторожны инкапсуляции нескольких ячеек в одну microgel, потому что читает из различных клеток, совместного использования одной и той же последовательности штрих-код не может быть bioinformatically отдельно. В случае 1 ячейка получает 2 различных штрих-кодов, штрих-код группы чистоты не влияет, хотя обилие метрики являются перекос при подсчете последовательностью штрих.
Капелька перекрестного загрязнения могут также возникнуть из-за условий субоптимальные слияния. Во время успешной операции microfluidic слияния устройство (рис. 5) можно controllably пара 1 капля штрих-код с 1 microgel и объем реагента ПЦР. Скорости потока non идеал приведет к капельку сопряжения на неправильное соотношение: 1 Штрих-код может быть в паре с 2 microgels, например. Все скорости потока, перечисленных в протоколе предназначены для оценки и может должны быть скорректированы в зависимости от незначительные колебания в размерах геометрии и капелька устройства. Пользователи с доступом к камерам с возможностями высокоскоростной записи (> 10 000 кадров в секунду) следует проверить правильный капелька слияния в начале и в течение microfluidic операции. Пользователи, не имеющие доступа к высокоскоростной камеры можно собрать небольшой объем слияния вывода и вручную измерения размеров капли под микроскопом. Размер капли должны быть однородным: избыток Необъединенное штрих-кодов или капли microgel указывает, что пласт ставки должна быть уменьшена соответственно.
Некоторые общие меры предосторожности следует при обработке microgels и microdroplets для сохранения их целостности. Microgels, хотя механически прочный, должны достаточно остынет до ломать и мытье шаги для обеспечения полной гелеобразование. Несферические microgels являются свидетельством того, что агарозы не было предоставлено достаточное время для затвердеть. При стирке microgels, спина суспензий вниз на требуемые скорости, чтобы избежать потери продукта. Гидрогель агарозы имеет преломления тесно соответствие воды и может быть трудно увидеть в трубку22, так что пользователям следует тщательно определить границы гель жидкость до аспирации. Капельки воды в нефти подвержены коалесценции наращивание статические силы23 на лабораторных перчаток и труб. По этой причине мы рекомендуем загрузки капелька пласт шприцы с голыми руками и лечения все линии пласт с пушкой антистатические до грунтовки насоса. Большое объединенное капельки могут быть удалены, медленно вращающийся эмульсии в шприц и вручную аспирационных большие капли, которые накапливаются в верхней из-за их больших сила.
SiC-seq является первой технологии для демонстрации одной ячейки генома из > 50,000 бактериальной клетки. Эта платформа предлагает значительные преимущества в пропускной способности на существующих подходов и позволяет глубже выборки гетерогенных микробных сообществ. На сегодняшний день microfluidic технологии для одной ячейки генома использовали microchambers9 и microwells24 ячейки изоляции и усиления, но с производительностью в диапазоне только десятков до сотен клеток. Сортировки потока одиночных клеток в wellplates5,6 требует не специализированные microfluidic приборы, но обладает аналогичным образом низкую пропускную способность. Учитывая, что образцы почвы и воды от окружающей среды обычно имеют альфа разнообразности > 1000 видов на уровне25,26, SiC-seq очень выгодно, в силу своей способности к образцу гораздо большее количество организмов. SiC-seq рабочий процесс адаптации клетки входы от Лаборатория культуры, окружающей среды или живые принимающей. Образец клеток нужно только быть в водной суспензии и свободной от крупных частиц (> 10 мкм) чтобы быть пригодным для инкапсуляции microfluidic. Например метод был применен ранее к выборке из морской воды с помощью ряда мыть и фильтрации шаги, чтобы предварительно обработать клетки до инкапсуляции17.
SiC-seq протокол создает сравнительно разреженные количество последовательности данных из каждой одной ячейки и не могут быть пригодны для всех приложений. Некоторые алгоритмы биоинформатики например de novo генома Ассамблеи или единичных нуклеотидных вариант (SNV) вызова требуют большей глубины охвата для эффективной работы. Вместо этого штрих-код группы могут быть кластеризованный в silico таксономических биннинга методы27 так что алгоритмы могут быть применены на большие наборы гласит. Относительно низкая эффективность штриховое кодирование SiC-seq рабочего процесса могут также представлять проблемы в тех случаях, когда наличие образца ввода является низким. НИЦ seq опирается на шаг инкапсуляции Пуассона распределены штрих, поэтому примерно 10% клеток получают молекулярной штрих-кодов и усиливаются на этапе подготовки окончательного библиотеки. Хотя это сопоставима с других схем на основе микрокапель штриховое кодирование10, пользователи, работающие с драгоценными клеток образцов могут испытывать трудности в достижении адекватного библиотека доходность для секвенирования и может потребоваться увеличить число циклов PCR в финале шаг амплификации. Другим потенциальным решение для пользователей с microfluidic опыт является сортировка положительных штрих капельки после этапа цифровой ПЦР, результате чего общей эффективности штриховое кодирование > 85%28.
Потенциального будущего направления для технологии SiC-seq адаптация рабочего процесса для использования с mammalian клеток, проложив путь для новых клинических исследований одноклеточных. Например, анализ числа вариаций копии среди один рак клеток мая далее наше понимание роли гетерогенность рака патологии2. Кроме того интеграции с существующими методами зонда и обогатить последовательностей ДНК интерес29 SiC-seq позволит Целевой последовательности одноклеточных субпопуляций или редких штаммов клеток. С экологические пробы гены от в пределах известных метаболический путь может целевых и контекстуально проанализированы вместе с соседней генов для выявления роман геномной острова. Из внутри человека хост-среды, низкий титр патогенных бактерий образцы могут быть изолированы и виртуализации на уровне одной ячейки для изучения более тесно их генотипической происхождение вирулентности.

Геном служит план сотовой идентичности и функции, содержащей весь организм программирования потенциал. Понимание на уровне генома клеточной биологии может объяснить наблюдаемое фенотипического разнообразия в гетерогенных клеточных популяций. Эта разнородность проявляется в биологических системах и имеет широкие последствия для здоровья человека и болезней. Например ген копии номер различия между опухолевые клетки связаны с эволюции и распространения рака1,2. В бактериальных инфекций острова патогенности, присутствующих в небольшую геномов могут передаваться по горизонтали и привести к распространению устойчивых к антибиотикам бактерий3,4. Основная задача по изучению геномов на уровне одной ячейки является низкое количество ДНК доступны, а также необходимость проанализировать тысячи клеток попробовать все разнообразие генотипов. По этим причинам ограничения в экспериментальной пропускной способности препятствуют эффективности исследований одноклеточных, стабилизатор результаты к наиболее распространенным клетки. Одноклеточных изоляции методы, такие как поток сортировки5,6, Оптический пинцет7, анкеровки в массовых гели8и микрофлюидика9 способны обработки сотен клеток для последовательности; Однако это только небольшая часть большинства образцов. Метод для одной ячейки генома с существенно более высокая пропускная способность позволит глубже и более полное профилирование клеточных популяций, тем самым изучение роли генотипической разнообразия в рамках этих общин.
Капелька микрофлюидика позволяет высок объём манипуляции клеток и биологических реагентов в миллионы пиколитр шкала реакторов. На сегодняшний день, микрокапель технологии были использованы для изучения шаблоны дифференциального выражений среди клеток из разнородных тканей10,11,12, глубоко последовательность длинные молекулы13,14 ,15и поведения хроматина иммунопреципитации последовательности (чип seq) анализ на отдельные ячейки16. Действительно microdroplets способны высокой пропускной способностью, разобщенным операций, что делает их поддаются приложений в одной ячейки геномики. Развитие этой технологии представляет свои собственные уникальные технологические проблемы, однако. Клетки должны лизированы, очищенная и усиливается с минимальным уклоном, чтобы равномерно образца клеточных популяций. Кроме того в отличие от polyadenylated мРНК стенограммы в mammalian клетках, существует без сопоставимых молекулярной мотив в геноме для облегчения захвата целевой нуклеиновой кислоты. По этим причинам одноклеточных генома было трудно осуществить в микрокапель платформах.
В этой работе мы предоставляем подробный протокол нашего сообщалось ранее одноклеточных microfluidic подход, способный секвенирования геномов десятки тысяч клеток в одном эксперимент17. С этой технологией, называется SiC-seq, бактериальные клетки инкапсулируются в мкм шкала гидрогелей и индивидуально лизированы, tagmented и объединена с микрокапель, содержащий уникальный олигонуклеотида штрих, который сращивания на геномной ДНК клетки через одного совпадения расширение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Гидрогели служат изолированные контейнеры, в которых высокий молекулярный вес геномной ДНК труднодоступных помещены, позволяя мелких молекул, таких как моющие средства и литические ферменты для доступа и очищают ДНК до18штриховое кодирование. Этот протокол обрабатывает > 50 000 единичных клеток в течение нескольких часов, в результате в библиотеке перепутываются, готовы к последовательности. После виртуализации, читает demultiplexed согласно их одной ячейки штрих последовательность, что приводит к dataset состоит из миллионов гласит, каждый с индексом сотовой.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td style="width:245px;">University Wafers</td>
			<td style="width:163px;">447</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 3025 photoresist</td>
			<td style="width:245px;">Microchem</td>
			<td style="width:163px;">17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td style="width:245px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:163px;">G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomasks</td>
			<td style="width:245px;">CadArt Servcies</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for mask designs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:245px;">Krayden</td>
			<td style="width:163px;">4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Degassing chamber</td>
			<td style="width:245px;">Bel-Art</td>
			<td style="width:163px;">42025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)</td>
			<td style="width:245px;">Corning</td>
			<td>294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquapel (hydrophobic glass treatment)</td>
			<td style="width:245px;">Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE-2 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:245px;">Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">309628</td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">27 gauge needles</td>
			<td style="width:245px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:245px;">New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)</td>
			<td style="width:245px;">3M</td>
			<td style="width:163px;">98-0212-2928-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">FC-40 fluorinated oil</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG-PFPE surfactant</td>
			<td style="width:245px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:163px;">008-FluoroSurfactant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Space heater</td>
			<td style="width:245px;">Lasko&#160;</td>
			<td style="width:163px;">CD09250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">a9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">TE (10X)</td>
			<td style="width:245px;">Rockland</td>
			<td style="width:163px;">mb-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PBS 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:245px;">E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-65083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">OptiPrep (density gradient medium)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">d1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Hexane</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysozyme Type IV</td>
			<td style="width:245px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">195303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Mutanolysin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zymolyase (yeast lytic enzyme)</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:163px;">e1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lysostaphin</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">EDTA</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:245px;">Teknova</td>
			<td style="width:163px;">d9750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Lithium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">L9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 200 Proof (100%)</td>
			<td style="width:245px;">Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">SYBR Green I (nucleic acid stain)</td>
			<td style="width:245px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">PEG 6k</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera DNA Library Prep Kit</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m05365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td style="width:245px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:163px;">4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)</td>
			<td style="width:245px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:163px;">m0538m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)</td>
			<td style="width:245px;">Illumina</td>
			<td style="width:163px;">FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Cold cathode fluorescent inverter</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td style="width:163px;">(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">DC power supply</td>
			<td style="width:245px;">Mastech</td>
			<td>HY1503D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">Zerostat 3 anti-static gun</td>
			<td style="width:245px;">Milty</td>
			<td>5036694022153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:513px;">3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td style="width:245px;">(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>See Supplemental Files for 3D print file</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymo DNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:245px;">Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ultrahigh-throughput microfluidic platform for single-cell genome sequencing

Технологии виртуализации претерпели парадигмы от массовых резолюции одноклеточных в ответ на меняющиеся понимания роли гетерогенность клеточных в биологических системах. Однако одноклеточных секвенирования большого населения затрудняется ограничения в обработке геномов для виртуализации. В этой статье мы описываем метод для одной ячейки генома (SiC-seq) который использует капелька микрофлюидика изолировать, чтобы усилить и штрих геномов одиночных клеток. Инкапсуляция клеток в microgels позволяет разобщенным очищения и tagmentation ДНК, в то время как слияние microfluidic эффективно пары каждый генома с уникальной одноклеточных олигонуклеотида штрих-кода, позволяя > 50 000 единичных клеток секвенировать в перспективе. Данные последовательности demultiplexed по штрих-коду, создание групп гласит, происходящих из одной клетки. Как высокой пропускной способностью и низкой предвзятость метод секвенирования одноклеточных SiC-seq позволят более широкий спектр геномных исследований, ориентированных на различных клеточных популяций.

Watch this Scientific Journal Video about An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing at JoVE.com

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Секвенирование одной ячейки показывает генотипическая гетерогенность в биологических системах, но современные технологии не хватает пропускной способности, необходимые для глубокого профилирования сообщества состав и функции. Здесь мы описываем microfluidic рабочего процесса для секвенирования > 50,000 одноклеточных геномов из различных мобильных популяций.

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-орган Chip - Микрожидкостных Платформа для долгосрочных Multi-ткани сокультивирования

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Изображения корневого волоска морфология Arabidopsis саженцев в два слоя Microfluidic платформа

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Долговечный чтения последовательности для анализа всей геномной ДНК

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...