Name: generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro at JoVE.com

프로토콜 및 원고에 관한 유용한 토론에 감사 Jolanta Chmielowiec 하 고. 우리는 또한 confocal 현미경에 접근을 위한 벤자민 Arenkiel 감사합니다. 이 작품은 NIH (P30-DK079638 M.B.)와 T32HL092332-13 마스와 M.B., 맥 네 어 의료 재단 (M.B.), 및 BCM 지적 발달 장애 연구 센터에서 confocal 코어에 의해 지원 되었다 (NIH U54 HD083092는 유 니스에서 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 건강 그리고 인간 발달).

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비
그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.
<ol><li>해 부에 대 한 설정, 얼음 양?...

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dawn+of+the+organoid+era:+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development,+disease,+and+regeneration.">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells.">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency.">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).</li><li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pancreatitis.">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+signals,+and+lineages+in+pancreas+development.">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors.">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells.">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation.">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li><li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1++pancreatic+progenitor+cells.">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool.">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors.">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney.">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li><li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells.">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li><li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromogranins+A+and+B:+the+first+25+years+and+future+perspectives.">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li><li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes.">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).</li><li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes.">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li><li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients:+prevalence,+mechanisms,+and+treatment.">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).</li><li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes.">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).</li><li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 ?...

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.
Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위6 과 대 장7 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장8, 망막9, 신장10,11, 그리고 대뇌12 organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.
질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분13,14, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 15당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호17제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.
여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포19의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillary Tubes</td>
			<td style="width:123px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:344px;">GB1007515</td>
			<td style="width:167px;">O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C5080</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell-Repellent 96-Well Microplate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:344px;">650970</td>
			<td style="width:167px;">U-bottom</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">233306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chromogranin-A antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Compact, Modular Stereo Microscope M60</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">C10310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Countess Cell Counter Slides</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">C10312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CryoStar NX70</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>957000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole-dihydrochloride)</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:344px;">10 236 276 001</td>
			<td style="width:167px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DBA antibody</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>RL-1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dispase II, Powder</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11330032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dnase I</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">18068-015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11251-10</td>
			<td style="width:167px;">0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">EGF (Epidermal growth factor)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">E9644</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:123px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:344px;">2716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:344px;">370</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:123px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:344px;">OB10001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3149-10KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">INSM1 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz BioTechnology</td>
			<td style="width:344px;">sc-271408</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:344px;">a4164</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isothesia Isoflurane, USP</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Insulin Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:344px;">A056401</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Guinea Pig</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KAPA SYBR FAST Universal</td>
			<td style="width:123px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:344px;">KK4618</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">KaryoMax</td>
			<td>10575090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">10828028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">442615</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse C-Peptide ELISA</td>
			<td style="width:123px;">ALPCO</td>
			<td style="width:344px;">80-CPTMS-E01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td style="width:123px;">ALPCO</td>
			<td style="width:344px;">80-INSMSU-E01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MX35 Microtome Blades</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:344px;">3052835</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S3817</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:344px;">017-000-121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pdx1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F6A11</td>
			<td>Monoclonal Mouse MIgG1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td style="width:123px;">VWR</td>
			<td style="width:344px;">15160-157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT30002CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">22431081</td>
			<td style="width:167px;">1.5mL Capacity</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-10 Protein</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">345-FG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-Acidic</td>
			<td style="width:123px;">Peprotech</td>
			<td style="width:344px;">100-17A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human R-Spondin I Protein</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">4546-RS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BenchRocker 2D</td>
			<td style="width:123px;">Benchmark</td>
			<td style="width:344px;">BR2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose 500g</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S0389</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:123px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:344px;">71310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Thermomixer R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">05-412-401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tissue Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:123px;">Sakura</td>
			<td style="width:344px;">4583</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">T8787</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">TrypLE Express</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">12604039</td>
			<td style="width:167px;">(1x), no Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypan Blue Stain</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">15250061</td>
			<td style="width:167px;">For cell counting slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">25-052-CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td style="width:167px;">Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vimentin Antibody</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:344px;">AB5733</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Chicken IgY</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:123px;">BioExpres</td>
			<td style="width:344px;">S-7350-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td style="width:167px;">Also known as ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Zeiss 710 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.
내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.
세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이?...

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro (Video) | JoVE

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays (Video) | JoVE

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

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인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

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기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

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능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

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두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

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마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

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3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

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Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

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첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

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인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...