Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

المؤلفين قد لا شكر وتقدير.

المواد الجينية المستخدمة هنا أخلاقيا وأقر لاستخدام المكتب "الأطفال هريك" (لجنة أخلاقيات البحوث البشرية) (قوات الدفاع المدني/07/492)، إدارة هريك الخدمات البشرية (10/07) ومستشفى (RCH الأطفال الملكي) هريك (27047).
1-تصميم التحليل متعدد
<ol><li>إعداد قائمة الحزب الوطني اﻻسكتلندي لتصميم المق?...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+gene+approach.">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li><li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method.">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li><li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy.">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical &amp; Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li><li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

هنا، علينا أن نظهر أسلوب التنميط متعدد باستخدام الطيف الكتلي. نتائج تمثيلية تم إنشاؤها باستخدام PCR يقترن استخدام-TOF الكتلي4 مع الكيمياء الإنزيم المدرجة في الجدول للمواد13. مع هذا النظام الأساسي، ونحن إنشاء مجموعة من الأنماط الجينية 11,295 على الأفراد 1,255 لبط...

في الأمراض البشرية المعقدة، المتغيرات الجينية تساهم قابلية المرض والتحديد الكمي لهذه المتغيرات قد تكون مفيدة لفهم الآلية المرضية، تحديد مجموعات المرضى عالية المخاطر، ومعاملة المستجيبين. في الواقع، الوعد بدقة الطب تعتمد على الاستفادة من المعلومات الجينية لتحديد مجموعات فرعية المريض1. ولسوء الحظ، داخل الفضاء بيولوجيا الأمراض المعقدة، حيث تعمل المرض هي مدعومة بالتغاير الوراثي الكبير، بينيترانسي منخفضة، والتعبيرية متغير، الفوج حجم الاحتياجات للنهج الشاملة للجينوم التعرف على الرواية المرشحين غالباً ما تكون باهظة كبيرة2. بدلاً من ذلك، يبدأ نهج جينات مستهدفة مرشح بداهة فرضية حول الجينات/مسارات محددة في مسببات المرض3. أدوات تحليل المسار تستخدم عادة للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية المكاني الهدف المحدد، توليد عدة مسارات المرشح استكشاف. علينا أن نظهر هنا نهجاً متعدد التنميط يسمح لتحقيق عشرات ومئات بطانات بمقايسة واحدة، مناسبة ل الدراسات الفوجية البشرية4. وهذا النهج مرتفع نسبيا من خلال، ضع، السماح لمئات آلاف عينات الحمض النووي لتكون جينوتيبيد لدراسات اكتشاف الرواية والتحقيق في مسارات محددة. الأساليب المذكورة هنا مفيدة لتحديد المخاطر الآليلات وروابطها مع السمات السريرية بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا. وكان هذا المنهاج مفيد جداً للفحص والتشخيص أغراض5،6، وأكثر في الآونة الأخيرة، للعدوى الميكروبية7 و8من فيروس الورم الحليمي البشري.
ويبدأ هذا البروتوكول مع اختيار مجموعة من الجينات للتحقيق، أي.، المناطق المستهدفة، عادة ما تحدد من خلال البحث في الأدب، أو فرضيات مسبقاً للمشاركة في عملية المرض؛ أو ربما المحدد للنسخ المتماثل كالرابطات الرائدة لدراسة الجينوم على نطاق الرابطة (GWA) اكتشاف. من مجموعة الجينات، وسوف حدد الباحث قائمة العلامة بطانات المكرر. هو اختلال الربط (دينار)، أو العلاقة بين المتغيرات في المنطقة يستخدم لتحديد ممثل 'الوسم SNP' لمجموعة من بطانات في LD عالية، المعروف باسم هابلوتيبي. LD عالية في المنطقة يعني أن بطانات غالباً موروثة معا من التنميط SNP واحدة غير كافية لتمثل الاختلاف في بطانات جميع في هابلوتيبي أن. بدلاً من ذلك، إذا كانت متابعة قائمة نهائية من بطانات من العديد من المناطق، على سبيل المثال-، النسخ المتماثل لدراسة GWA، قد تكون هذه العملية غير ضرورية. للتنميط متعدد، ثم ينبغي تصميم مقايسة حول هذه الأهداف الإشعال التضخيم من اختلاف الجماعية لتلك كبسولة تفجير ملحق والمنتجات لإنتاج التفسير الشامل الأطياف. وتنفذ هذه المعلمات بسهولة بتصميم أداة فحص الوراثي متعدد. سيتم استخدام الإشعال إلى الأمام وعكس من هذا التصميم لاستهداف علامات الاهتمام وتضخيم تسلسل يحتوي على الحزب الوطني اﻻسكتلندي. كبسولة تفجير ملحق إرفاق الدانية مباشرة إلى بطانات وإضافة قاعدة واحدة، وكتلة معدلة، 'المدمر' مكملة للحزب الوطني اﻻسكتلندي. كذلك يمنع قاعدة المنهي التمديد للحمض النووي. الكتلة--تعديل القاعدة تمكن أجزاء مختلفة من قاعدة واحدة الكشف عنها بواسطة الطيف الكتلي. ثم يتم تطبيق لوحة تحتوي على مادة الكيمياء الوراثي لشريحة للقياس على منصة الكتلي. بعد تطبيق ضوابط الجودة المناسبة لدعوات التنميط الخام الكشف عنها بواسطة النظام، يمكن تصدير البيانات ويستخدم للتحليل الإحصائي لاختبار الارتباط مع المرض تعمل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

وكثيراً ما تستند الأمراض المعقدة متعددة المتغيرات الجينية المشتركة التي تسهم في قابلية المرض. هنا، يمكننا وصف نهج تعدد الأشكال (SNP) النوكليوتيدات واحدة علامة فعالة من حيث التكلفة باستخدام فحص الوراثي متعدد مع الكتلي، للتحقيق في الجينات الطريق رابطات في الأفواج السريرية. نحن التحقيق موضع المرشح الحساسية الغذائية Interleukin13 (IL13) على سبيل مثال. هذا الأسلوب كفاءة تكبير التغطية بالاستفادة من اختلال الصلة المشتركة (LD) داخل منطقة. المحدد LD بطانات ثم صممت في تحليل متعدد، تمكين بطانات مختلفة تصل إلى 40 يتم تحليلها في الوقت نفسه، تعزيز الفعالية من حيث التكلفة. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تستخدم لتضخيم المكاني هدفا، يليه النوكليوتيدات واحدة، وتقاس في أمبليكونس ثم استخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-الوقت من flight(MALDI-TOF) الكتلي. ويتم تحليل الناتج الخام مع النمط الوراثي تطلق على البرمجيات، واستخدام تعريفات مراقبة الجودة الصارمة وانقطاع، وتحدد الأنماط الجينية الاحتمالية العالية والإخراج لتحليل البيانات.

مع البروتوكول، المذكورة أعلاه، ونحن جينوتيبيد الوسم بطانات عبر Th2 المناعي الجين IL13 في مجموعة من المواد الغذائية الحساسية حالات وضوابط9. قمنا بتطبيق تحليل الانحدار اللوجستي، بعد تعديلها للنسب وغيرها من المتغيرات المشاركة المحتملة، لاختبار ما إذا كانت ?...

Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي

تحديد المتغيرات الجينية المساهمة في الأمراض البشرية المعقدة يسمح لنا بتحديد آليات جديدة. وهنا، علينا أن نظهر نهجاً متعدد الوراثي للجينات المرشحة أو تحليل مسار الجين الذي يزيد من تغطية تكلفة منخفضة وهي قابلة للدراسات الفوجية.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

التصنيف الفرعي لل<em&gt; العطيفة الصائمية</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt; يعزل عن طريق PhyloProteomics أساس الطيف-قداس (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

عالية الدقة ذوبان ير ل تكمل مستقبلات 1 طول تعدد الأشكال التنميط الجيني: أداة مبتكرة لمرض الزهايمر الجينات تقييم القابلية

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...