Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Forfatterne har ingen anerkendelser.

Det genetiske materiale, der anvendes heri blev etisk godkendt til brug af Kontoret for børn HREC (Human forskning etiske komité) (CDF/07/492), Institut for Human Services HREC (10/07) og Royal children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. designe multipleksede analysen
<ol><li>Forberede assay design en SNP liste.<ol>
<li>Inddata målområde i funktionen mærker af Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Bruge LD (korrelation, Rasmussen2) mellem SNPs spannin...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+gene+approach.">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li><li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method.">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li><li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy.">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical &amp; Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li><li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

Her viser vi metode til multipleksede genotypebestemmelse ved hjælp af massespektrometri. De repræsentative resultater blev genereret ved hjælp af PCR parret med MALDI-TOF-massespektrometri4 med assay kemi listet i Tabel af materialer13. Med denne platform genereret vi ialt 11,295 genotyper på 1,255 personer for 9 SNPs inden for 40 h i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten af teknikken i besvarelsen genetiske hypoteser ved at g...

I menneskers komplekse sygdom, genetiske varianter bidrage til sygdom modtagelighed og kvantificere disse varianter kan være nyttig for forståelsen patogenese, identificerer patienten højrisikogrupper og behandling respondenter. Faktisk, løftet om præcision medicin er afhængig af udnytte genomiske information for at identificere patienten undergrupper1. Desværre, inden for det komplekse sygdomme biologi rum, hvor sygdommen fænotyper er understøttet af betydelige genetiske heterogenitet, lav penetrans og variabel ekspressivitet, kohorte størrelse krav til genome-wide tilgange til at identificere roman kandidater er ofte uoverkommeligt store2. Alternativt, en målrettet kandidat gen tilgang begynder med en apriori hypotese om specifikke gener/veje i sygdom ætiologi3. Sti analyseværktøjer er almindeligt anvendt til at undersøge Patofysiologi af et identificeret mål loci, genererer talrige kandidat veje skal undersøges. Vi viser her en multiplex genotypebestemmelse tilgang giver mulighed for undersøgelse af snesevis til hundredvis af SNPs med en assay, egnet til menneskelige kohorte studier4. Denne tilgang er relativt høj gennem-læg, tillader hundreder til tusinder af DNA-prøver skal genotypebestemmes for romanen discovery undersøgelser og efterforskning af specifikke veje. De metoder, der er skitseret her er nyttig til at identificere risikoen alleler og deres foreninger med kliniske træk i en relativt hurtig og billig måde. Denne platform er blevet meget fordelagtige for screening og diagnostiske formål5,6, og for nylig, for mikrobiel infektion7 og humant papillomvirus8.
Denne protokol begynder med udvælgelsen af et sæt af gener for undersøgelsen, dvs., målområder, typisk bestemmes gennem litteratur søgning, eller en på forhånd hypoteser for deltagelse i sygdomsprocessen; eller måske valgte for replikering som de førende sammenslutninger af en opdagelse genome-wide association (GWA) undersøgelse. Forskeren vil gen sæt Vælg et raffineret liste over tag SNPs. Det vil sige, bruges kobling ubalance (LD), eller korrelation, blandt varianter i regionen til at identificere en repræsentant 'tag SNP' for en gruppe af SNPs i høj LD, kendt som en haplotype. Den høje LD i regionen betyder, at SNPs ofte er arvet sammen, således at genotypebestemmelse en SNP er tilstrækkeligt til at repræsentere variationen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger op på en definitiv liste over SNPs fra mange områder, fx., replikering til en GWA undersøgelse, denne proces kan være unødvendig. For multipleksede genotypebestemmelse, skal en analyse derefter være konstrueret omkring disse mål sådan, at forstærkning primere er af forskellig masse til dem af de forlængelse primere og produkter til at producere fortolkelige masse spektre. Disse parametre der let kan implementeres af en multiplex genotypebestemmelse assay designværktøj. Frem og bak primere fra dette design vil blive brugt til at målrette markører af interesse og forstærke den sekvens, som indeholder SNP. Udvidelse primere vedhæfte direkte proksimalt for SNPs og en enkelt, masse-modificeret, "terminator" base, der supplerer SNP er tilføjet. Terminator base forhindrer yderligere udvidelse af DNA. Mass-ændring af basen giver fragmenter afviger en enkelt base til at blive opdaget af massespektrometri. Pladen indeholder genotypebestemmelse kemi derefter anvendes på en chip til måling på en massespektrometri platform. Efter anvender passende kvalitetskontrol på de rå genotypebestemmelse opfordringer registreret af systemet, kan data eksporteret og brugt til statistisk analyse til at teste for association med sygdom fænotyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

Komplekse sygdomme understøttes ofte af flere fælles genetiske varianter, der bidrager til sygdom modtagelighed. Her, beskriver vi en omkostningseffektiv tag enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) tilgang ved hjælp af en multiplex genotypebestemmelse assay med massespektrometri, til at undersøge gen pathway foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøger mad allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metode maksimerer effektivt dækning ved at udnytte fælles kobling ubalance (LD) inden for en region. Valgte LD SNPs er derefter designet i en multiplex assay, gør det muligt for op til 40 forskellige SNPs analyseres samtidig øge omkostningseffektiviteten. Polymerasekædereaktionen (PCR) anvendes til at forstærke target loci, efterfulgt af enkelt nucleotid udvidelse, og amplikoner derefter måles ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tid af flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Det rå output er analyseret med genotype kræver software, ved hjælp af strenge kvalitetskontrol definitioner og cut-offs, og høj sandsynlighed genotyper er fastlagt og output til dataanalyse.

Med den protokol, der er beskrevet ovenfor, tag vi genotypebestemmes SNPs på tværs af Th2 immun gen IL13 i en kohorte af mad allergi tilfælde og kontroller9. Vi anvendte logistisk regressionsanalyse, korrigeret for afstamning og andre potentielle kovariater, at teste, om de genetiske varianter inden for det pågældende område, øget mad allergi risiko. Tabel 10 9 viser, at en variant rs1295686 er forbundet med ...

Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Identifikation af genetiske varianter bidrager til komplekse menneskelige sygdom tillader os at identificere nye mekanismer. Her viser vi en multiplex genotypebestemmelse tilgang til kandidat gener eller gen pathway analyse, der maksimerer dækning til en lav pris og er indstillet til kohorte-baserede undersøgelser.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA transfektion og EMSA Analyser på frisk isoleret humant villus cytotrophoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

subtypning af<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolater Brug massespektrometri-baserede PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser af Cirkulerende miRNA i irritabel tyktarm Opdagede Ved hjælp af en Multiplexed Højkapacitetsforskning Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Højopløsnings smeltende PCR til komplementreceptor 1 Længde polymorfisme Genotyping: Et innovativt redskab til Alzheimers sygdomssensibilitetsvurdering

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Måling af genekspression i bombarderede Byg Aleurone lag med øget gennemløb

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...