Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
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Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Das genetische Material hierin verwendeten ethisch stimmte für den Einsatz des Amtes für Kinder HREC (menschliche Research Ethics Committee) (CDF/07/492), die Abteilung der menschlichen Dienstleistungen HREC (10/07) und die königlichen Kinder Krankenhaus (RCH) HREC (27047).
1. Gestaltung des Multiplex-Tests
<ol><li>Bereiten Sie eine SNP-Liste für Test-Design.<ol>
<li>Geben Sie die Zielregion der Tagger Funktion des Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Verwenden...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. 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D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

Hier zeigen wir die Methode der gemultiplexten Genotypisierung mittels Massenspektrometrie. Die repräsentativen Ergebnisse wurden mittels PCR gepaart mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie4 mit Assay Chemie entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien13generiert. Mit dieser Plattform haben wir insgesamt 11.295 Genotypen auf 1.255 Einzelpersonen für 9 SNPs innerhalb von 40 Stunden im Labor erzeugt.
Wir verdeutlichen den Nutzen der...

In komplexen Krankheiten genetische Varianten tragen zur Krankheitsanfälligkeit und Quantifizierung dieser Varianten kann nützlich sein für Verständnis Pathogenese, hohes Risiko Patientengruppen und Behandlung Responder zu identifizieren. In der Tat ist das Versprechen der präzisionsmedizin Nutzung genomischer Informationen zur Identifizierung von Patientengruppen1abhängig. Leider innerhalb der komplexen Krankheit Biologie Raum, wo Krankheit Phänotypen durch erhebliche genetische Heterogenität, geringe Penetranz und variabler Expressivität untermauert werden, Kohorte Größe Anforderungen für genomweite Ansätze zu identifizieren, Roman Kandidaten sind oft übermäßig groß2. Alternativ beginnt ein gezielte Kandidat gen Ansatz mit einer a priori Hypothese über bestimmte Gene/Wege in Krankheit Ätiologie3. Pfad-Analyse-Tools werden häufig verwendet, um die Pathophysiologie der eine identifizierte Ziel Loci, erzeugen zahlreiche Kandidaten Wege erforscht werden zu untersuchen. Wir zeigen hier einen gemultiplexten Genotypisierung Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Dutzende bis Hunderte von SNPs mit einem Assay, geeignet für menschlichen Kohorten Studien4. Dieser Ansatz ist relativ hohen Durchsatz, Hunderte bis Tausende von DNA-Proben für neuartige Entdeckung Studien genotypisiert sein und Untersuchung der spezifischen Bahnen erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden eignen sich für identifizierende Risiko-Allele und ihre Verbände mit klinischen Merkmale auf eine relativ schnelle und kostengünstige Weise. Diese Plattform ist sehr vorteilhaft für Screening und diagnostische Zwecke5,6, und seit kurzem auch für mikrobielle Infektion7 und humanes Papillomavirus8gewesen.
Dieses Protokoll beginnt mit der Auswahl aus einer Reihe von Genen für Untersuchung, d. h.., den Zielregionen, in der Regel bestimmt durch Literatur suchen oder a priori Hypothesen für die Beteiligung an den Krankheitsprozess; oder vielleicht für die Replikation als den führenden Vereinigungen einer Entdeckung genomweite (GWA) Studie ausgewählt. Aus dem Gen-Set wird der Forscher des Tags SNPs einen raffinierten auswählen. Das heißt, ist die Verknüpfung Ungleichgewicht (LD) oder die Korrelation unter den Varianten in der Region zum Vertreter 'Tag SNP' für eine Gruppe von SNPs in hohen LD, bekannt als ein Haplotyp identifizieren. Die hohen LD der Region bedeutet, dass die SNPs oft zusammen vererbt werden, so dass Genotypisierung ein SNP ausreichen, um die Variation an allen SNPs in den Haplotyp vertreten ist. Alternativ, wenn auf eine endgültige Liste der SNPs aus vielen Regionen, z.B.Follow-up., Replikation für eine GWA-Studie, dieser Prozess möglicherweise unnötig. Für Multiplex Genotypisierung ist ein Test dann um diese Ziele auszulegen, so, dass die Verstärkung Zündkapseln sind unterschiedlicher Masse derjenigen die Verlängerung Zündkapseln und Produkte herstellen interpretierbaren Spektren Masse. Diese Parameter werden leicht durch ein Multiplex Genotypisierung-Assay-Design-Tool implementiert. Die Forward- und reverse Primer von diesem Design werden verwendet werden, Zielen auf die Markierungen des Interesses und verstärken die Sequenz, die SNP enthält. Die Erweiterung Primer Anhängen direkt proximal zu den SNPs und eine einzelne, Masse verändert, 'Terminator'-Basis, die komplementär zu der SNP ist hinzugefügt. Die Terminator Basis verhindert eine weitere Verlängerung der DNA. Die Masse-Modifikation des Sockels kann Fragmente abweichend von einer einzelnen Base von Massenspektrometrie detektiert werden. Die Platte enthält die Genotypisierung Chemie wird dann auf einen Chip für die Messung auf einer Plattform Massenspektrometrie angewendet. Nach der Anwendung entsprechende Qualitätskontrollen, die rohen Genotypisierung Anrufe vom System erkannt, können die Daten exportiert und verwendet zur statistischen Auswertung, um Verbindung mit Krankheit Phänotypen zu testen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

Komplexe Krankheiten werden oft durch mehrere gemeinsame genetische Varianten untermauert, die Krankheitsanfälligkeit beitragen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Tag Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Ansatz mit einem gemultiplexten Genotypisierung Assay mit Massenspektrometrie, gen Weg Verbände in klinischer Kohorten zu untersuchen. Wir untersuchen Lebensmittel Allergie Kandidat Locus Interleukin13 (IL13) als Beispiel. Diese Methode maximiert effizient die Berichterstattung unter Ausnutzung der gemeinsamen Gestänge Ungleichgewicht (LD) innerhalb einer Region. Ausgewählten LD SNPs sind dann in einen Multiplex-Assay konzipiert ermöglichen bis zu 40 verschiedene SNPs gleichzeitig analysiert werden, Steigerung der Wirtschaftlichkeit. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um den Ziel-Loci, gefolgt von Einzel-Nukleotid-Erweiterung zu verstärken und die Amplifikate sind dann mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit der flight(MALDI-TOF) Massenspektrometrie gemessen. Die raw-Ausgabe wird mit dem Genotyp ruft Software, mit strengen Qualitätskontrolle Definitionen und Cut-Offs, analysiert und mit hoher Wahrscheinlichkeit Genotypen sind bestimmt und Ausgang für die Datenanalyse.

Mit dem oben beschriebenen Protokoll kennzeichnen wir genotypisiert SNPs über das Th2 immun gen IL13 in einer Kohorte von Nahrungsmittel-Allergie Fälle und Kontrollen9. Wir angewendet logistische Regressionsanalyse, bereinigt um Abstammung und andere potentiellen Kovariablen zu testen, ob die genetische Varianten innerhalb der Region des Interesses Lebensmittel-Allergie-Risiko erhöht. Tabelle 10 9 zeigt, dass ein...

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Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Identifizierung von Genvarianten, die einen Beitrag zur komplexen menschlichen Krankheit ermöglicht neuartige Mechanismen zu identifizieren. Hier zeigen wir einen Multiplex-Genotypisierung Ansatz Kandidatengene oder Weg Genanalyse, die maximiert die Reichweite bei niedrigen Kosten und Kohorte-Studien zugänglich ist.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

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Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

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