Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
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著者の謝辞があります。

ここで使用される遺伝物質倫理的によって承認された使用するためオフィス子供 HREC (人間研究倫理委員会) (CDF/07/492)、人間サービス HREC 部の (10/07) と王立子供病院 (RCH) HREC (27047)。
1. 設計多重アッセイ
<ol><li>試金のデザインの SNP リストを準備します。<ol>
<li>Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) のタガー機能にターゲット領域を入力します。必要なバリエーシ...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+gene+approach.">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li><li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method.">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li><li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy.">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical &amp; Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li><li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

ここでは、質量分析法による多重遺伝子型解析法を示します。代表的な結果は、MALDI-TOF 質量分析法4分析化学と材料表13に掲げると共に PCR を使用して生成されました。このプラットフォームでは、合計 40 時間以内 9 SNPs の 1,255 個人 11,295 遺伝子型をラボで生成されます。
生成し、食物アレルギーと独立した複製 phenotyped 探...

人間の複雑な疾患の遺伝的変異が疾患感受性に貢献、これらの亜種の定量化は理解病因、治療レスポンダーの高リスク患者のグループを識別するために有用かもしれない。確かに、精密医療の約束は患者サブグループ1を識別するためにゲノム情報を利用したに依存しています。残念ながら、どこ疾患表現型の相当な遺伝的多様性、低浸透度と変数表現力によって支えられている、複雑な病気の生物学領域内コホート サイズ ゲノム全体小説的なアプローチのための要件候補者は、しばしば膨大2です。また、標的候補遺伝子アプローチから始まる疾患病因3に固有の遺伝子/経路について事前の仮説。経路解析ツールは、探検するために多数の候補経路を生成する標的遺伝子座の病態生理学を調査するため使用されます。ここで人間のコホート研究4に適した 1 つの試金と Snp の数百人に数十の調査を可能にする多重遺伝子型アプローチを紹介します。このアプローチは比較的高スループット、数百、数千の新規探索研究誘因する DNA サンプルや特定経路の調査を許可します。ここで説明する方法は、比較的迅速かつ安価な方法で識別リスク対立遺伝子および臨床特徴との関連付けに役立ちます。このプラットフォームは、微生物感染症7ひと乳頭腫ウイルス8スクリーニングおよび診断目的5,6と最近では非常に有利にされています。
調査の結果、すなわち遺伝子のセットを選択から始まるこのプロトコル、文献検索、または病気プロセスに関与の先験的な仮説によって通常決定対象地域。または、おそらく選択した探索ゲノム広い連合 (GWA) 研究の主要な団体としてレプリケーション。遺伝子セットから研究者はタグ SNPs の洗練されたリストを選択します。つまり、連鎖不平衡 (LD)、または地域での亜種間で相関が高い LD、ハプロタイプと呼ばれる中の Snp のグループの代表的な 'タグを SNP を識別するために使用されます。地域の高い LD 継承を意味します、SNPs がしばしば一緒に遺伝子型 1 つの SNP がハプロタイプですべての Snp で変化を表すために十分になるよう。また、フォロー アップ SNPs の決定的なリストから多くの地域、例えば場合。、GWA 研究のレプリケーションでは、このプロセス必要がありますされません。多重遺伝子型は増幅プライマー拡張プライマーの質量が異なるは、解釈を生成する製品の質量スペクトル、アッセイは、これらのターゲットの周り設計されなければなりません。これらのパラメーターは、多重遺伝子型分析設計ツールによって簡単に実装されます。このデザインから前方および逆のプライマーは、SNP を含むシーケンスを増幅して興味のマーカーをターゲットに使用されます。拡張プライマーを直接 SNPs に近位付 SNP に補足である単一、大量更新、'ターミネーター' ベースが追加されます。ターミネーター ベース DNA の拡張をできなくなります。ベースの質量の変更により、質量分析による検出を 1 つのベースが異なるフラグメント。ジェノタイピング化学を含むプレート質量分析プラットフォームに測定用チップに適用されます。適切な品質管理をシステムによって検出された生ジェノタイピング呼び出しに適用すると、データをエクスポートし、疾患表現型との関連付けをテストするのには統計分析に使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

複雑な病気の多くの場合疾患感受性に貢献する複数の一般的な遺伝子変異によって支えられています。ここでは、ジェノタイピング マルチプレックス アッセイ質量分析法を用いた臨床コホートで遺伝子経路の連合を調査するコスト効果の高いタグ単一ヌクレオチド多型 (SNP) アプローチについて述べる。例として食品アレルギー候補遺伝子座Interleukin13 (IL13) を調べた。このメソッドは、領域内の共有連鎖不平衡 (LD) を利用して効率的にカバレッジを最大化します。選択した LD SNPs、設計されています多重アッセイに同時に分析するまで 40 の異なる Snp の有効化費用対効果を高めます。ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は単一のヌクレオチドの拡張子、ターゲット遺伝子を増幅するため使用され、amplicons マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間 flight(MALDI-TOF) 質量分析装置を使用して測定されます。Raw 出力を厳格な品質管理の定義と切り取りトレードオフを使用してソフトウェアを呼び出す遺伝子で解析、確率が高い遺伝子型の決定しデータ分析のための出力します。

上記プロトコルを使用我々 は誤は食品アレルギーの場合とコントロール9のコホートにおける Th2 免疫遺伝子IL13の SNPs をタグ付け。関心領域内の遺伝的変異が食品アレルギー リスクを増加させるかどうかをテストするのには、祖先とその他の潜在的な共変量調整後のロジスティック回帰分析を行った。テーブル 109</su...

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Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

複雑な人間の病気に貢献する遺伝的変異の同定機構を識別することができます。ここでは、候補者の遺伝子または遺伝子パスウェイ解析低コストでカバレッジを最大化、コホートに基づく研究に従う方法多重遺伝子型を示します。

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

のサブタイピング<em&gt;カンピロバクター・ジェジュニ</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;質量分析ベースのPhyloProteomics（MSPP）を使用して分離株

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

補体受容体1長多型のための高分解能Melting PCR Genotyping：アルツハイマー病の遺伝子感受性評価のための革新的なツール

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

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遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

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