Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
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저자 아무 승인 있다.

여기서 사용 하는 유전 물질은 윤리적으로 사용 하기 위해 승인 사무실 어린이 HREC (인간 연구 윤리 위원회) (CDF/07/492), 인간 서비스 HREC의 부서에 대 한 (10/07)와 로얄 어린이 병원 (RCH) HREC (27047).
1. 설계 다중화 분석 결과
<ol><li>시험 디자인에 대 한 SNP 목록을 준비 합니다.<ol>
<li>Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads)의 늘어진 장식을 붙이는 기능으로 대상 영역을 입?...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

여기, 다중화 된 유전형 질량 분석을 사용 하 여 방법을 설명 합니다. 대표 결과 MALDI TOF 질량 분석4 분석 결과 화학 재료의 표13에 나열와 결합 하는 PCR를 사용 하 여 생성 되었다. 이 플랫폼으로 실험실에서 총 1,255 개인 40 h 이내 9 Snp에 대 한 11,295 genotypes 생성 했습니다.
우리는 생성 SNP 후보 유전자 IL13 발견 임상 코 호트 ?...

인간의 복잡 한 질병에 유전 이체 질병 민감성에 기여 하 고 이러한 변형 측정 이해 병 인, 고 위험 환자 그룹, 및 치료 조치를 식별 하는 데 유용 있을 수 있습니다. 실제로, 정밀 의학의 약속은 환자 서브 그룹1을 식별 하는 게놈 정보를 이용 하 여 의존 합니다. 불행히도, 공간 내에 복잡 한 질병 생물학, 어디 질병 고기 상당한 유전이 성분, 낮은 penetrance, 가변 표현력에 의해 underpinned 아 르, 일대 소설 식별을 게놈 넓은 접근에 대 한 요구 사항 크기 후보 들은 엄청나게 큰2입니다. 또한, 대상된 후보 유전자 접근 질병 병 인3특정 유전자/경로 대 한 선험적 가설으로 시작합니다. 경로 분석 도구 일반적으로 탐구 될 수많은 후보 경로 생성 한 확인된 대상 loci의 이상 조사 하는 데 사용 됩니다. 여기 다중화 유전형 접근 인간의 코 호트 연구4에 적합 한 분석 결과 함께 Snp의 수백 수만의 조사에 대 한 수 있도록 설명 합니다. 이 방식은 상대적으로 높은 통해-넣어, 수백 수 소설 발견 연구에 대 한 genotyped DNA 샘플의 수천 및 특정 경로 조사를 허용 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 유용 식별 위험 대립 유전자 및 임상 특성의 그들의 협회에 대 한 상대적으로 신속 하 고 저렴 한 방식으로 합니다. 이 플랫폼은 미생물 감염7 및 인간 유 두 종 바이러스8등에 대 한 검사 및 진단 목적5,6, 최근, 매우 유리한 되었습니다.
이 프로토콜은 조사, 즉유전자의 세트의 선택과 시작., 일반적으로 문학 검색, 또는 질병 과정;에 참여에 대 한 선험적 가설을 통해 결정 대상 지역 또는 아마도 검색 게놈 넓은 협회 (GWA) 연구의 주요한 연결으로 복제에 대 한 선택. 유전자 집합에서 연구원 태그 Snp의 세련 된 목록을 선택 합니다. 즉, 결합 불균형 (LD), 또는 지역에서 변종 사이 상호 관계는 haplotype 이라고 높은 LD에 Snp의 그룹에 대 한 대표 '태그 SNP' 식별 하 데 사용 됩니다. 지역의 높은 LD는 유전형 한 SNP는 haplotype에서 모든 Snp에 변화를 표현 하기 위해 충분 한 Snp는 함께 상속 자주는 것을 의미 합니다. 또는, 많은 지역, 예를 들어에서 Snp의 최종 목록에 다음과 같은 경우., GWA 연구에 대 한 복제,이 프로세스 해야 하지. 멀티플렉스 유전형 분석 결과 다음 설계 되어야 합니다 이러한 목표 주위는 증폭 뇌관 연장 뇌관의 질량 다른의 고 해석할 생산 제품 질량 스펙트럼. 이 매개 변수는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 디자인 도구에 의해 쉽게 구현 됩니다. 이 디자인에서 앞으로 역 뇌관 관심의 마커를 대상 하는 SNP를 포함 하는 시퀀스를 증폭에 사용 됩니다. 확장 뇌관은 Snp에 직접 인접 연결 하 고 단일, 대량 수정, '터미네이터' 기반은 SNP에 보완을 추가 됩니다. 터미네이터 자료 추가 DNA의 확장을 방지합니다. 기지의 대량 수정 파편을 질량 분석에 의해 감지 되는 단일 자료에 의해 다른 수 있습니다. 유전형 화학을 포함 하는 접시 측정 질량 분석 플랫폼에 대 한 칩에 적용 됩니다. 시스템에 의해 감지 원시 유전형 호출에 적절 한 품질 제어를 적용 한 후 데이터는 수출 고 연관 질병 고기에 대 한 테스트에 통계 분석을 위해 사용 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

복잡 한 질병 종종 질병 민감성에 기여 하는 여러 일반적인 유전자 변종에 의해 underpinned 아 르. 여기, 우리는 질량 분석, 있는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 사용 하 여 임상 동료에 있는 유전자 통로 협회 조사 비용 효율적인 태그 단일 염기 다형성 (SNP) 접근을 설명 합니다. 우리는 예를 들어 음식 알레르기 후보 소재 시 Interleukin13 (IL13)를 조사합니다. 이 메서드는 효율적으로 지역 내의 공유 결합 불균형 (LD)을 이용 하 여 범위를 최대화 합니다. 선택 된 LD Snp는 다음에 설계 다중화 분석 결과 40 다른 Snp 동시에 분석할 수 있도록 비용 효율성을 향상. 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 확장명 대상 loci를 증폭 하는 사용 되 고 있는 amplicons 다음 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 flight(MALDI-TOF) 질량 분석을 사용 하 여 측정 됩니다. 원시 출력 소프트웨어, 엄격한 품질 관리 정 및 컷-오프를 사용 하 여 호출 하는 유전자 형을 분석 하 고 높은 확률 genotypes 되 고 데이터 분석에 대 한 출력.

위에서 설명한 프로토콜, genotyped 우리는 Th2 면역 유전자 IL13 의 음식 알레르기의 경우 및 컨트롤9일대에 걸쳐 Snp를 태그. 우리 음식 알레르기 위험을 증가 하는 관심의 영역 내에 유전자 변형 여부를 테스트 하는 조상과 다른 잠재적인 covariates에 대 한 조정 하는 로지스틱 회귀 분석을 적용. 표 10 9 한 변형 rs1295686 도전...

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Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

보체 수용체 1 길이 다형성 유전자 타이핑을위한 고해상도 Melting PCR : 알츠하이머 병 유전자 감수성 평가를위한 혁신적인 도구

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

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유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...