Name: candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Forfatterne har ingen takk.

Det genetiske materialet brukes her var etisk godkjent for bruk av Office for barn HREC (menneskelige forskning etikk) (CDF/07/492), Institutt for Human Services HREC (10/07) og Royal Children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. design multiplex analysen
<ol><li>Forberede en SNP liste analysen design.<ol>
<li>Inn målregion taggeren funksjon Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Bruk LD (korrelasjon, r2) mellom SNPs spenner målregion for å generere en lis...

<ol>
	<li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine.">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li><li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+GWAS:+power,+sample+size,+and+data+structure.">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li><li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+gene+approach.">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li><li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+(MassARRAY).">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li><li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research.">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry:+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis.">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).</li><li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method.">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li><li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy.">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical &amp; Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li><li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis.">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).</li><li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale,+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma.">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li><li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study.">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li><li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPLEX+assay:+Increased+plexing+efficiency+and+flexibility+for+MassARRAY+system+through+single+base+primer+extension+with+mass-modified+terminators.">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li><li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping.">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li><li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP:+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap.">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li></ol>

Her viser vi metoden multiplex genotyperingteknologi bruker massespektrometri. Representant resultatene ble generert bruker PCR sammen med MALDI-TOF massespektrometri4 med analysen kjemi oppført i Tabell for materiale13. Med denne plattformen generert vi totalt 11,295 genotyper på 1,255 individer for 9 SNPs innen 40 timer i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten av teknikken med å besvare genetisk hypoteser ved å generere og ana...

I menneskelige komplekse sykdom, genetisk varianter bidrar til sykdom mottakelighet og kvantifisere disse variantene kan være nyttige for forståelsen patogenesen, identifiserer pasienten høyrisikogrupper og behandling respons. Løftet om presisjon medisin er faktisk avhengig utnytte genomisk informasjon for å identifisere pasienten undergrupper1. Dessverre innen komplekse sykdom biologi, der sykdommen fenotyper er understøttet av betydelig genetisk heterogenitet og lav penetrance variabel expressivity, kohort størrelse krav for genomet hele tilnærminger til å identifisere roman kandidater er ofte prohibitively store2. Alternativt begynner en målrettet kandidat genet tilnærming med en en priori hypotese om bestemte gener/stier i sykdom etiologi3. Sti analyseverktøy brukes vanligvis til å undersøke i Patofysiologien ved en identifiserte målet loci, genererer mange kandidat stier å bli utforsket. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming slik at etterforskningen av titalls til hundrevis av SNPs med ett analysen, egnet til menneskelig kohort studier4. Denne tilnærmingen er relativt høy lakkeringsverksteder, tillater hundrevis til tusenvis av DNA-prøver å være genotyped for romanen oppdagelsen studier og undersøkelser av bestemte stier. Metodene som er nevnt her er nyttig for å identifisere risiko alleler og tilknytning med klinisk trekk i en relativt rask og billig måte. Denne plattformen er svært fordelaktig for sortering og diagnostiske formål5,6, og mer nylig for mikrobielle infeksjoner7 og humant papillomavirus8.
Denne protokollen begynner med valg av gener for etterforskning, dvs., regionene mål, typisk fastsettes gjennom litteratur søker, eller en priori hypoteser for engasjement i sykdommen prosessen; eller kanskje valgte for replikering som ledende sammenslutninger av en oppdagelse genomet hele association (GWA) studie. Fra Gen sett velge forskeren en raffinert over koden SNPs. Dvs brukes den sammenhengen ulikevekt (LD) eller korrelasjon mellom varianter i regionen til å identifisere en representant "tag SNP" for en gruppe med SNPs i høy LD, kjent som en haplotype. Den høye LD i regionen betyr at SNPs er ofte arvet sammen slik at genotyperingteknologi en SNP er tilstrekkelig til å representere variasjonen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger på en endelig liste med SNPs fra mange områder, f.eks., replikering for en GWA studie, denne prosessen kan være unødvendig. For multiplex genotyperingteknologi, må analysen deretter være utformet rundt disse målene slik at forsterkningen primerne er ulik masse de forlengelsen primerne og produkter å produsere interpretable masse spectra. Disse parameterne er lett implementert av en multiplex genotyperingteknologi analysen design verktøyet. Revers primerne fra denne designen brukes til målet markører av interesse og forsterke sekvensen som inneholder av SNP. Utvidelse primerne knytte direkte proksimale til SNPs og en enkelt, masse endring, "terminator"-base som er komplementære til av SNP er lagt. Terminator basen forhindrer ytterligere utvidelse av DNA. Masse-endring av basen kan fragmenter ulike av én base kan oppdages av massespektrometri. Platen inneholder genotyperingteknologi kjemi brukes deretter til en chip for måling på en massespektrometri plattform. Etter bruker riktig kvalitetskontroll rå genotyperingteknologi samtaler registrert av systemet, kan dataene eksporteres og brukt til statistisk analyse for å teste for tilknytning sykdom fenotyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Genomic DNA&#160;</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">1 &#956;L at a concentration of 5-10 ng/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Primers: forward and reverse amplification and extension</td>
			<td style="width:127px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:235px;">see manuscript section 1.2.1 on design of primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water&#160;</td>
			<td style="width:127px;">E.g. Milli-Q water&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>deionized with 18.2 M&#937;.cm resistivity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">#10148-2</td>
			<td style="width:235px;">includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR plates (384-well)</td>
			<td style="width:127px;">Abgene</td>
			<td style="width:119px;">#ABGAB-1384</td>
			<td style="width:235px;">For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipettes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>single and 8-channel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>compatible with 384-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimple resin plate&#160;</td>
			<td>Agena Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>6mg, 384-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate rotator&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MassARRAY Analyzer 4 System</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:235px;">MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization &#8211; time of flight) Mass Spectrometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS1000 Nanodispenser</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Assay Design Suite</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tool used to design the multiplex genotyping assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot Start Taq</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA polymerase enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resin&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Agena Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Supplied with iPLEX kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candidate gene testing in clinical cohort studies with multiplexed genotyping and mass spectrometry

Komplekse sykdommer er ofte understøttet av flere vanlige genetisk varianter som bidrar til sykdom mottakelighet. Her beskriver vi en kostnadseffektiv tag single nukleotid polymorfisme (SNP) tilnærming med en multiplex genotyperingteknologi analysen massespektrometri, undersøke genet veien foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøker mat allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metoden maksimerer effektivt dekning ved å utnytte delte sammenhengen ulikevekt (LD) innenfor et område. Valgte LD SNPs deretter utformes i en multiplex analysen, slik at opptil 40 forskjellige SNPs skal analyseres samtidig øke kostnadseffektivitet. Polymerasekjedereaksjons (PCR) brukes til å forsterke målet loci, etterfulgt av single nukleotid utvidelse, og amplicons er deretter målt ved hjelp av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-tid av flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Rå produksjon er analysert med genotype ringe programvare, med streng kvalitetskontroll definisjoner og avskjær, og høy sannsynlighet genotyper er bestemt og for dataanalyse.

Med protokollen beskrevet ovenfor, vi genotyped merke SNPs over Th2 immun genet IL13 i en kohort av mat allergi tilfeller og kontroller9. Vi brukt logistisk regresjonsanalyse, justert for opphav og andre potensielle covariates, å teste om genetisk variantene i regionen rundt økt mat allergi risiko. Tabell 10 9 viser at en variant rs1295686 er knyttet til utfordring-bevist matallergi og vi bekreftet dette forening ...

Watch this Scientific Journal Video about Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry at JoVE.com

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Identifikasjon av genetisk varianter bidra til komplekse menneskelig sykdom tillater oss å identifisere romanen mekanismer. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming til kandidat gener eller genet sti analyse som maksimerer dekningen til lav pris og er mottakelig for kohort-baserte studier.

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfeksjon og EMSA Analyser på nylig isolerte humane villøse Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

inndeling i undergrupper av<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolater Bruke massespektrometri-baserte PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser av sirkulerende mirnas i Irritabel tarm syndrom oppdages ved hjelp av en multiplekset Høy throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Høyoppløselig smeltende PCR for komplementreceptor 1 Lengdepolymorfisme Genotyping: Et innovativt verktøy for Alzheimers sykdomssesmerksvurdering

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Måle genuttrykk i bombet Bygg Aleurone lag med økt gjennomstrømming

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...