Name: an in vitro model to study the effect of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on staphylococcus aureus biofilm
Uploaded: 2018-04-16T15:00:00
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Este trabalho foi financiado pela natureza nacional Science Foundation da China para jovens estudiosos (n º 81300810), programa de treinamento de Shanghai jovem médico (n º 20141057) e Nacional Natural Science Foundation da China (81671982, 81271791 e 81571955). Gostaríamos de agradecer LetPub (www.letpub.com) para fornecer assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.

1. formação de biofilmes
<ol><li>
Formação de biofilmes em microplacas de 96 poços
	<ol>
<li>Recuperar a cepa S. aureus USA300 e 3 formadoras de biofilme clínicas cepas (C1 - C3) armazenadas a-80 ° C. Nota: A capacidade das estirpes clínicas para formar biofilmes foi determinada pelo ensaio de placa de microtitulação descrito anteriormente15.</li>
		<li>Inocular a bactéria num meio de caldo (TSB) 5ml triptona soja e cultivar em uma incubadora com agitaçã...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riddle+of+biofilm+resistance.">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).</li><li>Rabin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+mechanisms+and+targets+for+developing+antibiofilm+agents.">Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents.</a> Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+(APDT)+using+a+660+nm+laser+and+malachite+green+dye+in+Staphylococcus+aureus+biofilms+arranged+on+compact+and+cancellous+bone+specimens.">In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens.</a> Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).</li><li>Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+using+a+660+nm+laser+and+methyline+blue+dye+for+inactivating+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+compact+and+cancellous+bones:+An+in+vitro+study.">Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).</li><li>Mai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+effect+of+sinoporphyrin+sodium+photodynamic+therapy+on+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cultures.">The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures.</a> Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).</li><li>Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+by+disruptive+strategies.">Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies.</a> Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).</li><li>Baltazar, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy:+an+effective+alternative+approach+to+control+fungal+infections.">Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections.</a> Front Microbiol. 6, 202 (2015).</li><li>Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+novel+approaches+for+control+of+dental+biofilm.">Current and novel approaches for control of dental biofilm.</a> Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).</li><li>De Sordi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Photodynamic+Antimicrobial+Chemotherapy+(PACT)+for+Clostridium+difficile.">Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile.</a> PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).</li><li>Harris, F., Pierpoint, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+based+on+5-aminolevulinic+acid+and+its+use+as+an+antimicrobial+agent.">Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent.</a> Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).</li><li>Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+photodynamic+therapy.">Antifungal photodynamic therapy.</a> Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).</li><li>Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+Candida+albicans+biofilms:+An+in+vitro+study.">Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).</li><li>Zhang, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+and+its+strain-dependent+combined+effect+with+antibiotics+on+Staphylococcus+aureus+biofilm.">5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm.</a> PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).</li><li>Chang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single+cell+detection+of+Staphylococcus+aureus+by+aptamer-conjugated+gold+nanoparticles.">Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles.</a> Sci Rep. 3, 1863 (2013).</li><li>Barra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+and+Antibiotic+Therapy+in+Combination+to+Fight+Biofilms+and+Resistant+Surface+Bacterial+Infections.">Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections.</a> Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).</li><li>St Denis, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+you+need+is+light:+antimicrobial+photoinactivation+as+an+evolving+and+emerging+discovery+strategy+against+infectious+disease.">All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease.</a> Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).</li><li>O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+bacteria+in+multi-species+biofilms+can+be+killed+by+red+light+in+the+presence+of+toluidine+blue.">Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue.</a> Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-aminolevulinic+acid-mediated+photodynamic+therapy+on+antibiotic-resistant+staphylococcal+biofilm:+an+in+vitro+study.">Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study.</a> J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).</li><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Elias, S., Banin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-species+biofilms:+living+with+friendly+neighbors.">Multi-species biofilms: living with friendly neighbors.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Proof+of+Programmed+5-Aminolevulinic+Acid+Prodrug+Nanocarriers+for+Targeted+Photodynamic+Cancer+Therapy.">Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).</li></ol>

PDT tem sido uma terapia estudada para o tratamento de câncer, desde que foi inventado há mais de 100 anos18. Na última década, PDT foi aplicado como uma estratégia antimicrobiana e demonstrou eficácia contra algumas bactérias patogénicas resistentes a antibióticos,12. Comparado ao estado planctônico, biofilmes bacterianos parecem ser mais resistentes ao tratamento com antibióticos3, enquanto o efeito de ALA-PDT em biofilmes não foi total...

S. aureus é um importante patógeno Gram-positiva que coloniza a pele e mucosa de hospedeiros humanos. Sua capacidade de forma de biofilmes é considerada um aspecto importante de sua patogênese1. Biofilmes bacterianos são uma comunidade de bactérias incorporado em uma matriz de produção própria, que é composta de substâncias poliméricas extracelulares, incluindo polissacarídeo, DNA e proteínas. Esta matriz desempenha um papel significativo na persistência de infecções bacterianas, contribuindo para um alto grau de resistência ao sistema imunológico humano e terapias antimicrobiana atual2. Os antibióticos são ainda o principal tratamento para infecções de biofilme, embora os efeitos dos antibióticos sobre biofilmes são limitados. Ficou demonstrado anteriormente que as células em biofilmes são 10 a 1.000 vezes mais resistentes a antibióticos em comparação com suas contrapartes planctônicos3. Assim, estratégias alternativas são necessárias para conquistar esse problema.
PDT, uma alternativa de tratamento para infecções bacterianas, usa a luz de um comprimento de onda apropriado para ativar fotossensibilizadores. Isto leva à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são letais para as células alvo por perturbar a parede celular, inativando as enzimas e danificar o DNA4. Esta característica multi-alvo torna difícil para que as bactérias desenvolver resistência ao tratamento de PDT.
O efeito antimicrobiano do PDT em biofilmes bacterianos e fungos, com vários fotossensibilizadores, tais como o azul de toluidina, verde de malaquita, azul de metileno, cloro e6 e porfirinas, tem sido estudado em anteriores relatórios5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, um pró-fármaco do fotossensibilizador real, PpIX, caracteriza-se por seu peso molecular pequeno e rápido desembaraço12,14. Estas vantagens dão grande potencial ALA-PDT como uma aplicação terapêutica. Embora o efeito de ALA-PDT em bactérias planctônicas tem sido estudado por muitos grupos de12, o efeito antimicrobiano do ALA-PDT em biofilmes bacterianos ainda não foi elucidado. Entretanto, é difícil comparar os resultados entre os estudos anteriores. Uma das razões é que os diferentes protocolos são usados por diversos grupos. Assim, este protocolo descreve um modelo in vitro de um sistema de ALA-PDT, com base na nossa anterior trabalho15. O efeito deste modelo foi confirmado pelo cálculo do UFC e viabilidade de coloração com CLSM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptone Soya Broth (TSB)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>CM0129B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Soya Agar (TSA)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>CM0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L7012</td>
			<td>The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L7012</td>
			<td>The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-aminolevulinic acid (ALA)</td>
			<td>Fudan Zhangjiang Bio-Pharm</td>
			<td>3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus strain USA300</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>The source of USA 300 references &#8220;Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>3599</td>
			<td>Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodish</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>801001</td>
			<td>Glass bottom, Non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5417</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z365998 |&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE4000</td>
			<td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light emitting diode (LED)</td>
			<td>Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO</td>
			<td>LED-IB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS AF software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model to study the effect of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on staphylococcus aureus biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) é um patógeno humano comum, que causa infecções sistêmicas e piogênica. S. aureus infecções são difíceis de erradicar, não só devido ao surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, mas também sua capacidade de forma de biofilmes. Recentemente, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido indicada como um dos tratamentos possíveis para controlar infecções de biofilme. No entanto, mais estudos são necessários para melhorar o nosso conhecimento de seus efeitos sobre biofilmes bacterianos, bem como os mecanismos subjacentes. Este manuscrito descreve um modelo in vitro do PDT com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), um precursor do fotossensibilizador real, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduras S. aureus biofilmes foram incubados com ALA e em seguida, expostos à luz. Posteriormente, o efeito antibacteriano do ALA-PDT no biofilme de S. aureus foi quantificado calculando as unidades (CFUs) formadoras e visualizado pela viabilidade fluorescente coloração através de laser confocal, microscopia (CLSM). Resultados representativos demonstraram um forte efeito antibacteriano do ALA-PDT sobre biofilmes de S. aureus . Este protocolo é simples e pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes de S. aureus com ALA-PDT. No futuro, ela também pode ser referenciada em estudos de PDT, utilizando outros fotossensibilizadores para diferentes cepas bacterianas com ajustes mínimos.

A viabilidade das bactérias nos biofilmes foi diminuída após o tratamento de ALA-PDT quando comparados aos controles (ALA - diodo emissor de luz, ALA + LED - e ALA-LED +) em USA300 e das três estirpes clínicas (Figura 1).
Para confirmar os resultados do UFC ensaio e observam o antibacteriano, efeito de ALA-PDT sobre o S. aureus biofilme em situ, os biofilmes USA300 foram visua...

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An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

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