Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

ونشكر دومون مجلي وميلوني رولاندو لقراءة نقدية من المخطوطة وإيفيكتور و "فينوبارك ICM النوى" للمساعدة التقنية في إنتاج ناقلات لينتيفيرال والحيوان السكن على التوالي. هذا العمل كان يدعمه دي ترانسلاتيونليس المعهد الجامعي هوسبيتالو "دي علوم الأعصاب" باريس، رامي-A-ICM، يشرف دعفينير ANR-10-إيايهو-06. العلاقات العامة وتلقى التمويل للفرنسية Langue de الرابطة من أجل دراسات دو Diabète et des علل Métaboliques (الفيديام) ومن JDRF مشترك/منح INSERM.

كافة الإجراءات التي تشمل أعمال الحيوانات حصلوا على الموافقة الأخلاقية وقد أذنت بالوزارة الفرنسية للبحوث والتعليم تحت رقم أبافيس #5094-20 v6 16032916219274 و 05311.02. مرفق الحيوان ICM فينوبارك قد اعتمدتها وزارة الزراعة الفرنسية تحت رقم الاعتماد B75 13 19. البروتوكول الشامل يتطلب تنفيذ كل إجراء في إطار زمني م...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات في بويضات مخصبة الموصوفة هنا أدت إلى إنتاج أجنة معدلة وراثيا التي أسفرت عن أكثر من 70% أجنة المعدلة وراثيا بالقياس إلى مجموع عدد الأجنة التي تم جمعها. هذه النتيجة تتسق مع التقارير السابقة وتجسد خصوصية الإجراء2،،من7<sup...

العمل الريادي جوردون et al. في عام 1980 وأظهرت أن حقن الحمض النووي بلازميد في الذكور برونوكلي من بويضات مخصبة بعد زرع في الفئران بسيودوبريجنانت، يمكن أن تسفر عن إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي تدمج بلازميد الحمض النووي1. المظاهرة أن الثدييات المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد كان له تأثير هائل على علوم الحياة العالمية، وفتح الطريق إلى حقول جديدة من البحث سواء بالنسبة للعلوم الأساسية والعلوم الطبية الحيوية متعدية الجنسيات. في العقود الأربعة الماضية، أصبح الحمض النووي microinjection ممارسة روتينية. على الرغم من أن تم إنتاج عدد هائل من الفئران المحورة وراثيا، غير قابلة للاستخدام الكامل لجميع سلالات الماوس الطريقة القياسية ويتطلب وقتاً طويلاً باككروسيس2،3. تطبيقه على الأنواع الأخرى ويظل التحدي4 والعائد التكامل التحوير عموما تقتصر على نسبة قليلة من الحيوانات ولدت5. وباﻹضافة إلى ذلك، فعالية التكامل التحوير يمثل عاملاً يحد من يشرح العائد الإجمالي الفقراء pronuclear حقن الحمض النووي. وفي هذا الصدد، النواقل الفيروسية التكاملية هي الأدوات الأكثر فعالية لنقل البضائع وإدماج المتسلسلات وبالتالي يمكن أن توفر وسائل جديدة زيادة غلتها التكامل والقيد الوحيد هو أن الحجم التحوير الذي لا يمكن أن يتجاوز 10 كيلو بايت6 .
لينتيفيرال ناقلات الزائفة المكتوبة مع البروتين يأت من فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) هي أدوات نقل الجينات بانتروبيك وتكاملية عالية ويمكن استخدامها ترانسدوسي بويضات مخصبة7. Zona pellucida المحيطة بويضات حاجزاً فيروس طبيعي ويحتاج لتمريرها إلى السماح بتوصيل مع ناقلات لينتيفيرال. الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها بواسطة بويضات مخصبة ترانسدوسينج بعد الحفر الصغيرة أو إزالتها من8، zona pellucida9. ومع ذلك، يبدو الحقن تحت zona pellucida في الفضاء بيريفيتيليني أن أبسط طريقة للبيض المخصب كما هو موضح في البداية ب لويس والزملاء7ترانسدوسي.
حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات يسمح الغلات العالية في إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي أعلى من 70% حيوانات ولدت. هذا العائد ما يزيد على 10 إضعاف أعلى من عائد أفضل ما يمكن تحقيقه باستخدام معيار pronuclei الحمض النووي حقن7،10،11. وفي هذا السياق، سينشئ جلسة واحدة من حقن مؤسسي المحورة وراثيا على الأقل 50 (F0). ، ولذلك العدد الكبير من مؤسسي متوافق مع phenotyping أثر التحوير مباشرة أجريت على الفئران F0 دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الماوس المحورة وراثيا. هذه الميزة تسمح للفحص السريع لتأثير التحوير وتكييف خصيصا لأداء في فيفو المكسب والخسارة للدراسات وظيفة في غضون أسابيع. وباﻹضافة إلى ذلك، العناصر التنظيمية الحمض النووي يمكن أيضا سرعة فحص لخريطة معززات وزخارف الحمض النووي ملزمة بالنسخ العوامل11،12. مع حقن برونوكليار، دمج المتسلسلات عادة نسخ متعددة كما في موضع فريد من نوعه. مع نواقل لينتيفيرال، يحدث التكامل في مواضع متعددة كنسخة واحدة كل10،موضع13. ولذلك، تعدد المكاني المتكامل الأكثر احتمالاً المرتبطة penetrance التعبير عالية جداً في مؤسسي المحورة وراثيا، مما يجعل هذا النموذج التي تم إنشاؤها جديدة أكثر قوة.
الأهم من ذلك، عند استخدام حقن برونوكليار للحمض النووي، التصور من برونوكلي أثناء الإجراء مطلوب على الإطلاق. يمنع هذا التقييد التقنية استخدام بويضات مخصبة مصدرها مجموعة كبيرة ومتنوعة من سلالات الماوس. ولذلك، إنتاج نموذج المعدلة وراثيا في محدد السلالة التي برونوكلي غير مرئية يتطلب إنتاج الحيوانات في سلالة متساهلة تليها على الأقل 10 باككروسيس المتعاقبة لنقل التحوير في الماوس المطلوبة سلالة. مع حقن متجه لينتيفيرال، بيريفيتيليني الفضاء دائماً مرئياً والحقن لا تتطلب مهارات محددة للغاية. على سبيل مثال، تم الحصول على موافقة/مشمولان الفئران المعدلة وراثيا التي لا تكون مناسبة لحقن برونوكلي مع حقن النواقل الفيروسية14.
هنا، يقدم بروتوكول شامل للسماح بإنتاج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الحقن لينتيفيرال المتجهات في الفضاء بيريفيتيليني جنين المرحلة خلية واحدة بسيطة. التعبير التحوير يسيطر مع أما في كل مكان أو المروجين الخلية المحددة يتم وصف بالتفصيل.
واستخدمت في هذه الدراسة15العمود الفقري لينتيفيرال ΔU3 بتريب. يسمح هذا متجه لإنتاج النسخ المتماثل ناقلات لينتيفيرال المعيبة التي تسلسل U3 جزئيا وحذفت لإزالة نشاط المروج U3 وتوليد متجه (سين) الذاتي إيناكتيفاتينج16. الأسهم ناقلات لينتيفيرال تم إنتاجها بواسطة عابر تعداء الخلايا HEK-293T مع p8.91 تغليف بلازميد (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6، فكمف-ز ترميز بروتين سكري-ز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي17، و ΔU3 بتريب ناقل المؤتلف. ويرد الإجراء إنتاج مفصلة كأساليب تكميلية.
إنتاج مخزون متجه لينتيفيرال عيار عالية تتم تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى الثاني (BSL-2). وهذا صحيح بالنسبة لمعظم المتسلسلات باستثناء المسرطنة التي يمكن إنتاجها في BSL-3. ولذلك، يكفي بالإنتاج في ظروف BSL-2 لمعظم الحالات. وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون قطع الاستخدام والإنتاج لمعظم الوكالات التنظيمية الوطنية التي تتعامل مع الكائنات المحورة وراثيا (جينياً). ويمكن استخدام كميات محدودة من النسخ المتماثل غير كفء الخطيئة ناقلات لينتيفيرال (أقل من 2 ميكروغرام من البروتين قفيصه p24) تحت ظروف BSL-1 كما هو موضح بالوكالة "الفرنسية المعدلة وراثيا" بالاتفاق مع توصيات الاتحاد الأوروبي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

لما يقرب من 40 عاماً، يمثل حقن الحمض النووي برونوكلير الطريقة القياسية لتوليد الفئران المحورة وراثيا مع التكامل العشوائي المتسلسلات. هذا إجراء روتيني ويستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم، وأن العقبة الرئيسية تكمن في ضعف فعالية التكامل التحوير، أدى إلى انخفاض عائد من الحيوانات مؤسس. أدمجت في المائة عدد قليل فقط من ولد بعد زرع بويضات مخصبة حقن الحيوانات التحوير. على النقيض من ذلك، الناقلة لينتيفيرال أدوات قوية لنقل الجينات التكاملية واستعمالها ترانسدوسي بويضات مخصبة يسمح الإنتاج ذات كفاءة عالية لمؤسس الفئران المعدلة وراثيا وبمتوسط إنتاج أعلى من 70%. وعلاوة على ذلك، أي سلالة الماوس يمكن استخدامها لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا و penetrance التعبير التحوير مرتفعة للغاية، فوق 80% مع لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة مقارنة microinjection الحمض النووي. حجم الجزء الحمض النووي التي يمكن أن تكون البضائع المتجهة لينتيفيرال يقتصر على 10 كيلو بايت ويمثل القيد الرئيسي لهذا الأسلوب. استخدام بسيطة وسهلة لإجراء الحقن تحت zona pellucida من بويضات مخصبة، يمكن أن تنتج أكثر من 50 مؤسس الحيوانات في جلسة واحدة من microinjection. هذا أسلوب تكييف عالية لأداء، مباشرة في الحيوانات مؤسس والربح السريع والخسارة للدراسات الدالة أو إلى مناطق الحمض النووي الجينومي الشاشة لقدرتها على ضبط وتنظيم الجينات التعبير في فيفو.

الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول المعروضة هنا. الممثل النتائج على حد سواء في كل مكان ويتم توضيح نوع الخلية المحددة التحوير التعبير.
التعبير التأسيسي المتسلسلات
دعاة في كل م...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

هذه الطريقة تسمح بسرعة في فحص الجسم الحي في الفئران، من تأثير transgene، ويتم تكييفها خصيصا لأداء مكاسب أو فقدان الدراسات الدالة، فضلا عن إجابة ورسم خرائط دافع الحمض النووي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية، هي أن استخدام التنبؤ للحيوانات المعدلة وراثيا هي أكثر من 70٪ من حديثي الولادة ويمكن تطبيقها على أي سلالات الفئران بما في ذلك الحيوانات المعدلة وراثيا. بعد القتل الرحيم الفئران، وجمع oviducts.لبدء الجراحة، استخدم المقص لإجراء شق أفقي كبير في تجويف البطن. ثم، حدد موقع oviduct بين الرحم والمبيض. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا منحنية لإزالة mesometrium والغشاء مع الأوعية الدموية البارزة.ثم، فصل oviduct من المبيض وتشريح أوفيدوكت من المبيض. ثم، سحب على oviduct وقطع بعيدا عن الرحم. نقل جميع oviducts التي تم جمعها إلى M2 المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.عند التعامل مع oviducts، يجب الحرص على تجنب لمس أمبولا منتفخة محملة بالبويضات المخصبة. المقبل، إضافة قطرة 100 ميكرولتر من حل عمل الهيالورونيداز إلى طبق 10 سم. ثم نقل اثنين من oviducts في ذلك، لإزالة خلايا الركام من البيض.تحت مجسم مجسم، استخدم زوج من حقن الأنسولين لتأمين oviduct أثناء تمزيق الأمبولا وتشتيت البويضات المخصبة. ثم، استخدام ماصة الزجاج المعدة مع أنابيب وساعة لسان حال لpirate جميع البيض. باستخدام هذه الأداة، نقلها بين ست قطرات من M2 المتوسطة لغسل قبالة الخلايا الرمول المحيطة بها.ثم، نقل البيض غسلها في بئر 10 ملليمتر، في لوحة أربعة بئر، مليئة بحماية M16. ثم، نقل الطبق إلى حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية. وفي إطار التحضير، تقوم أجهزة الطرد المركزي بتعليق ناقل العدس فيركال على 160 غراما لمدة دقيقتين، لتكوير الحطام الموجود في كثير من الأحيان في مخزون من فيروسات العدسي.في الطبقة اثنين من مجلس الوزراء سلامة، نقل اغراء إلى أنبوب جديد 0.5 ملليلتر. المقبل، تحميل ميكرولتر واحد من سوبرنات، في ماصة حقن. ثم، إرفاق ماصة الحقن إلى الجانب الأيمن micromanipulater.وإرفاق الماصة القابضة على الجانب الأيسر من المايكروmanipulator. الآن، الاستغناء عن ثمانية ميكروليتر من M2 المتوسطة في وسط الشريحة الاكتئاب. وتغطي مع النفط parafin الخفيفة لتجنب التبخر.ثم، ضع 20 بيضة في المواقع الضحلة في الهبوط دون خلق فقاعات. بعد ذلك، تأكد من أن غيض من ماصة الحقن مفتوح. إذا لم يكن كذلك، اضغط على ماصة الحقن مع ماصة عقد لفتحه.ثم، تعيين الحقن المجهري لحقن 20 ثانية. الآن، وذلك باستخدام ماصة عقد والضغط اليدوي التعرق بويضة المخصبة التي تحتوي على اثنين من pronuclei واثنين من الهيئات القطبية. ثم، باستخدام ماصة حقن حقن الفضاء ما بين البيض.لا تلمس غشاء البلازما. ضبط الضغط بحيث يتم تعبئة الفضاء perivitelline مع الحل. يجب أن لا يتجاوز الضغط 600 باسكال هيكتو.مباشرة بعد حقن البيض 20، نقل دفعة في حمام من M16 المتوسطة مسخن مسبقا. واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل زرعها. بعد 16 ساعة من تزاوج الإناث العاديات على الذكور مع قطع القناة الدافقة، تحقق من سدادات الجماع.استخدم هذه الإناث للزرع. المقبل، وجعل ماصة زرع مع القطر الداخلي من حوالي 150 ميكرون. ومع النصائح المصقولة اللهب التي هي حوالي أربعة إلى خمسة ملليمترات طويلة.تحميل ماصة مع الجنين اختبارها، والنفط البارافين الخفيفة إلى أعلى فقط نقطة الكتف. ثم، الطامح فقاعة الهواء الصغيرة وتحميل مزيد من الماصات مع M2 المتوسطة. بعد ذلك، تعرق فقاعة هواء ثانية.الآن، وضع الأجنة في ماصة واحدة وراء الأخرى، والتقليل من حجم المتوسطة بين الأجنة. الانتهاء، عن طريق التعرق قطرة صغيرة جدا من النفط parafin واحد فقط على نطاق واسع. إعداد ماصة إعادة الزرع هو المفتاح ويحتاج إلى الكثير من الممارسة.يجب أن يكون البيض في الماصات محاذاة مع عمليا أي وسيلة بينهما. بعد ذلك ، بعد تخدير الماوس وتأكيد التخدير مع قرصة إصبع قدم حلاقة قبالة اثنين ، اثنين من شرائح سنتيمتر من الشعر على طول الحبل الشوكي على مستوى الضلع الأخير. الآن، ضع الماوس على وسادة التدفئة على حقل معقمة والستائر، وترك نافذة على الجلد المكشوف.المقبل, تطهير الجلد المكشوفة مع الدعك بالتناوب من يودوبروفيدون و 70 في المئة الإيثانول. للزرع، أولاً إجراء شق عرضي سنتيمتر واحد، ثم حرك الجلد بشكلٍ ثُمى حتى يظهر المبيض البرتقالي الملون عبر جدار الجسم. المقبل، وجعل شق خمسة ملليمتر مع مقص غرامة والتقاط وسادة الدهون مع المشبك البلدغ اتاوماتيك.بمجرد أن يتم الإمساك بالوسادة ، اسحب المبيض ، وoviduct وأعلى الرحم. بعد ذلك، حدد موقع أمبولا وجعل hemisection مع مقص vannas، على الجزء oviduct التي تربط المبيض إلى أمبولا. ثم أدخل ماصات الجنين ونقل وإخراج البيض.وقف في فقاعة الهواء الأولى بعد أن تم الافراج عن البيض. وقد المواد المطلوبة على استعداد لتكرار الإجراء على oviduct الثاني. وبمجرد الانتهاء، أغلق الجلد مع مقاطع الجرح.مباشرة بعد إغلاق الجلد، داخل قنينة داخل الجسم ووضع الحيوان في غرفة الانتعاش مع عنصر التدفئة 39 درجة مئوية. مراقبة حتى أنها مستيقظا تماما. تم إنشاء المعدل وراثيا باستخدام الطريقة المعروضة.تم إنتاج متجهات العدسة عالية باستخدام محسن قاعدة 2.3 كيلو لـ Neurogenin-3 لدفع eGFP. أو كتحكم، جزء من الكروموسوم ستة لدفع eGFP. وكان الاندماج في الأجنة ناجحا إلى حد ما.من الأجنة، تم تقسيم برعم البنكرياس والمناعة للبحث عن التعبير الموضعي لـ eGFP. أكثر من 90 في المئة من ناقلات, مع محسن Neurogenin-3, أعرب eGFP في Neurog3 أعرب عن الخلايا. ومع ذلك، لم يعبر أي من ناقلات المكافحة المتكاملة عن eGFP في برعم البنكرياس.تم تقييم مواقع التكامل عبر جيني بواسطة PCR الكمية، باستخدام جين CDX2 كتحكم. وكان متوسط عدد مواقع التكامل حوالي 20 باستخدام بناء Neurogenin-3، أو 10 باستخدام بناء التحكم. الغريب، titer transduction الفيروسية المستخدمة لبناء Neurogenin-3، كان حوالي ضعف ناقلات مكافحة.اقتراح علاقة بين تتر النقل وعدد عمليات التكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد أعداد كبيرة من الأجنة المتحولة وراثيا المؤسس باستخدام حقن مارفيتيلين من ناقلات العدسة مع فعالية عالية. بمجرد اتقانها ، يمكن لهذه التقنية إنتاج ما يصل إلى 50 حيوانًا مؤسسًا في غضون يوم واحد من الحقن المجهري ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل حقن الحمض النووي الاتر النوى، من أجل إنشاء خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لا تنس أن العمل مع ناقلات الزفيرة يخضع لإذن من لجنة الكائنات المعدلة وراثيا المحلية الخاصة بك. ويمكن أن تكون هذه النواقل خطرة للغاية وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

الإنتاج السريع في الفطريات عن طريق<em&gt; الأجرعية</em&gt; التحول بوساطة أوسكار حذف يبني

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

سريع الفضة تلطيخ البروتوكول تمكين بسيطة والكشف عن كفاءة من علامات الاشتراكية السوفياتية باستخدام هلام Polyacrylamide يشوه عدم

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

كريسبر بوساطة "تحرير الجينوم" "البشري مسببات الأمراض الفطرية" المبيضات البيض

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...