Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Vi takker Magali Dumont og Rolando Meloni for kritisk læsning af håndskriftet, iVector og Phenoparc ICM kerner til teknisk bistand i lentiviral vektor produktion og dyr bolig henholdsvis. Dette arbejde blev støttet af Institut Hospitalo-Universitaire de neurovidenskab Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. modtaget støtte til foreningen de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) og en fælles JDRF / INSERM give.

Alle procedurer, der omfatter animalske arbejde har fået etiske godkendelse og er godkendt af det franske ministerium for forskning og uddannelse under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 og 05311.02. ICM Dyrefacilitet PHENOPARC er blevet akkrediteret ved den franske landbrugsministeriet under akkreditering nummer B75 13 19. Den samlede protokollen kræver udfører hver procedure inden for en præcis tidsramme, der er opsummeret i i figur 1.
1. animalsk køb o...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

Perivitelline injektion af lentiviral vektorer i befrugtede oocytter beskrevet her resulterede i produktionen af transgene embryoner, der gav mere end 70% af transgene embryoner i forhold til samlede antal indsamlet embryoner. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere betænkninger og eksemplificerer specificiteten af procedure2,7,10,11,12. Når man s...

Det banebrydende arbejde af Gordon et al. i 1980 viste, at efter implantation i pseudopregnant mus, plasmid DNA injektion i den mandlige pronuclei af befrugtede oocytter kan give produktionen af transgene dyr, som integreres i plasmid DNA1. Demonstration at transgene pattedyr kan genereres havde en enorm indflydelse på globale biovidenskab, åbner vejen for nye felter af forskning både for Grundvidenskab og translationel biomedicinske videnskaber. I de sidste fire årtier, er DNA mikroinjektion blevet en rutinemæssig praksis. Selv om et enormt antal af Transgene mus har været produceret, standard metode er ikke fuldt brugbar for alle mus stammer og kræver tidskrævende backcrosses2,3. Dets anvendelse til andre arter forbliver udfordrende4 og den samlede transgen integration udbytte er begrænset til et par procent af født dyr5. Desuden, repræsenterer effekten af transgenet integration den begrænsende faktor, der forklarer den fattige samlede udbytte af pronuclear DNA injektion. I denne henseende Integrativ virale vektorer er de mest effektive værktøjer til fragt og integrere transgener og dermed kunne give nye midler til at øge integrationen udbytte, den eneste begrænsning er, at den transgene størrelse ikke kan overstige 10 kb6 .
Lentiviral vektorer pseudo maskinskrevet med indhylle protein af vesikulær Stomatitis Virus (VSV) er pantropic og højt Integrativ gen overførsel værktøjer og kan bruges til at transduce befrugtede oocytter7. Zona pellucida omkring oocyter er en naturlig virus barriere og skal være bestået for at tillade transduktion med de lentiviral vektorer. Transgene dyr er blevet genereret af transducing befrugtede oocytter efter mikro-boring eller fjernelse af zona pellucida8,9. Indsprøjtning under zona pellucida i perivitelline rum synes imidlertid at være den enkleste metode til at transduce de befrugtede æg som oprindeligt beskrevet af Lois og kolleger7.
Perivitelline injektion af lentiviral vektorer giver høje udbytter i produktionen af transgene dyr, der er over 70% af født dyr. Sådant udbytte er over 10-fold højere end det bedste udbytte, der kan opnås ved hjælp af standard pronuclei DNA injektion7,10,11. I denne forbindelse vil en enkelt session af injektioner generere mindst 50 transgene stiftere (F0). Det store antal af grundlæggerne er derfor kompatible med fænotyper af transgenet effekten direkte udføres på F0 mus uden at skulle generere Transgene mus linjer. Denne fordel giver mulighed for hurtig screening af transgenet virkning og er specielt tilpasset til at udføre i vivo gevinst og tab af funktion undersøgelser inden for uger. Derudover kan regulerende DNA elementer også hurtigt screenes for at kortlægge smagsforstærkere og DNA motiver bundet af transskription faktorer11,12. Med pronuclear injektioner integrere transgener normalt som flere eksemplarer i en unik locus. Med lentiviral vektorer sker integration i flere loci som en enkelt kopi pr. locus10,13. Derfor er mangfoldighed af integrerede loci sandsynligvis knyttet til den meget høje udtryk penetrans observeret i transgene stifterne, hvilket gør den nye genererede model mere robust.
Vigtigere, når du bruger pronuclear injektion af DNA, er visualisering af pronuclei under proceduren, der absolut nødvendige. Denne tekniske begrænsninger forhindrer brugen af befrugtede oocytter med oprindelse fra en lang række mus stammer. Derfor, produktion af transgene model i en bestemt stamme for hvilke pronuclei er usynlige kræver produktion af dyr i en eftergivende stamme efterfulgt af mindst 10 successive backcrosses at overføre transgenet i den ønskede mus stamme. Med lentiviral vektor injektioner, perivitelline plads er altid synlig og injektion kræver ikke meget specifikke færdigheder. Som et eksempel, er NOD/SCID Transgene mus, ikke der er relevante for pronuclei injektion opnået med den virale vektor injektioner14.
Her præsenteres en omfattende protokol for at tillade simpel produktion af Transgene mus bruger lentiviral vektor injektioner i perivitelline rum i en én celle stadium embryo. Transgenets udtryk styres med enten allestedsnærværende eller celle specifikke initiativtagere er beskrevet i detaljer.
PTrip ΔU3 lentiviral rygrad var brugt i denne undersøgelse15. Denne vektor giver mulighed for at producere replikering defekte lentiviral vektorer, hvor U3 sekvensen er blevet delvist slettet for at fjerne U3 promotor aktivitet og generere en selvstændig inactivating vektor (synd)16. Lentiviral vektor bestande blev produceret af forbigående Transfektion af HEK-293T celler med p8.91 indkapsling plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodning vesikulær stomatitis-virus (VSV) glycoprotein-G17og pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Detaljerede produktionsregler fremgangsmaade som supplerende metoder.
Produktion af høj titer lentiviral vektor lagre udføres biosikkerhed niveau II betingelser (BSL-2). Dette gælder for de fleste transgener undtagen onkogener, der skal produceres i BSL-3. Derfor er produktionen i BSL-2 betingelser for de fleste tilfælde tilstrækkelig. Desuden er brug og produktion normalt afbrudt for de fleste nationale reguleringsorganer beskæftiger sig med genetisk modificerede organismer (GMO). Begrænsede mængder af replikering inkompetente synd lentiviral vektorer (under 2 µg af p24 kapsid proteiner) kan anvendes på BSL-1 betingelser som beskrevet af det franske GMO agenturet i samarbejde med EU 's henstillinger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

I næsten 40 år repræsenterer pronuclear DNA injektion den standard metode til at generere Transgene mus med tilfældige integration af transgener. Sådan en rutinemæssig procedure anvendes bredt i hele verden og dens vigtigste begrænsning er bosat i den fattige effekten af transgenet integration, hvilket resulterer i et lavt udbytte af grundlægger dyr. Kun få procent af dyr født efter implantation af injicerede befrugtede oocytter har integreret transgenet. Derimod lentiviral vektorerne er kraftfulde værktøjer for Integrativ genoverførsel og deres anvendelse til transduce befrugtede oocytter giver højeffektiv produktion af grundlægger Transgene mus med en gennemsnitlige udbytte over 70%. Endvidere, enhver mus stamme kan bruges til at producere transgene dyr og penetrans af transgenet udtryk er ekstremt høje, over 80% med lentiviral medieret transgenese i forhold til DNA mikroinjektion. Størrelsen af det DNA-fragment, der kan last ved den lentiviral vektor er begrænset til 10 kb og repræsenterer den største begrænsning af denne metode. Ved hjælp af en enkel og let at udføre injektion procedure under zona pellucida af befrugtede oocytter, kan mere end 50 grundlægger dyr produceres i en enkelt session af mikroinjektion. En sådan metode er meget tilpasset til at udføre direkte i grundlægger dyr, hurtig gevinst og tab af funktion undersøgelser eller at skærmen genomisk DNA regioner for deres evne til at styre og regulere gen udtryk i vivo.

Transgene dyr blev genereret ved hjælp af den protokol, der præsenteres her. Repræsentant resultater både allestedsnærværende og celle type specifikke transgen udtryk er illustreret.
Konstituerende udtryk af transgener
Allestedsnærværende initiativtagere er grundlæggende forskningsværktøjer til at udtrykke transgener i en vedvarende og effek...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieret produktion af Transgene mus: en enkel og meget effektiv metode til direkte undersøgelse af grundlæggerne

Vi præsenterer her, en protokol for at fremme transgen integration og produktion af grundlægger Transgene mus med høj effektivitet ved en simpel indsprøjtning af en lentiviral vektor i perivitelline rum af et befrugtet oocyt.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Denne metode giver mulighed for hurtig in vivo screening i mus, af effekten af et transgene, og er specielt tilpasset til at udføre gevinst eller tab af funktion undersøgelser, samt et svar og DNA motiv kortlægning. Den største fordel ved denne teknik er, at forudsigelsesbrugen af transgene dyr er over 70 % af de nyfødte og kan anvendes på alle musestammer, herunder transgene dyr. Efter aflive musene, indsamle fårukker.Til at begynde operationen, skal du bruge en saks til at gøre et stort vandret snit i bughulen. Derefter skal du finde oviductet mellem livmoderen og æggestokken. Dernæst skal du bruge buede kraftbecer til at fjerne mesometrium og membranen med de fremtrædende blodkar.Derefter adskilles fårukten fra æggestokkene og dissekerer fårukten fra æggestokken. Derefter slæbebåd på oviduct og skæres væk fra livmoderen. Overfør alle de indsamlede får til M2 medium ved stuetemperatur.Ved håndtering af oviducts, være omhyggelig med at undgå at røre den hævede ampulla læsset med befrugtede æg. Dernæst tilsættes en 100 microliter dråbe hyaluronidase arbejdsløsning til en 10 centimeter skål. Derefter overføre de to oviducts ind i det, for at fjerne cumulus celler fra æggene.Under et stereomikroskop skal du bruge et par insulinsprøjter til at sikre oviducten, mens ampullaen rives i stykker og spreder de befrugtede æg. Brug derefter en forberedt glaspipette med slanger og et mundstykke til at aspirere alle æggene. Ved hjælp af dette værktøj, overføre dem mellem seks dråber M2 medium til at vaske de omkringliggende cumulus celler.Derefter overføres de vaskede æg til en 10 millimeter brønd, i en fire brøndplade, fyldt med forvarmet M16. Derefter overføre skålen til en befugtet 37 grader Celsius inkubator. Som forberedelse centrifuger den forberedte lentiviral vektoraffjedring ved 160 g i to minutter for at pelletere de rester, der ofte er til stede i lentiviral lager.I et klasse to sikkerhedsskab skal supernatanterne overføres til et nyt 0,5 milliliterrør. Dernæst indlæse en mikroliter af supernatant, i en indsprøjtning pipette. Derefter fastgøres injektionspipetten til højre mikromanipulater.Og fastgør holdepipetten til mikromanipulatoren i venstre side. Nu dispensere otte mikroliter af M2 medium i midten af depression dias. Og dække med lys parafin olie for at undgå fordampning.Derefter placere 20 æg i de lavvandede steder i dråben uden at skabe bobler. Sørg derefter for, at spidsen af indsprøjtningspipetten er åben. Hvis ikke, skal du trykke på indsprøjtningspipetten med holdepipetten for at åbne den.Derefter indstilles mikroinjektoren til 20 sekunders injektioner. Nu ved hjælp af bedriftpipette og manuel tryk aspirere et befrugtet æg, der indeholder to pronuclei og to polære organer. Derefter, ved hjælp af injektion pipette injicere perivitelline rummet af ægget.Rør ikke ved plasmamembranen. Juster trykket, så perivitellinerummet er fyldt med opløsning. Trykket må ikke overstige 600 hekto pascals.Umiddelbart efter injektion af 20 æg, overføre partiet i et bad af forvarmet M16 medium. Og inkuber dem i mindst 30 minutter, før de implanteres. 16 timer efter parring normale hunner til hanner med vasectomies, kontrollere for copulation stik.Brug disse hunner til implantationen. Dernæst gør implantation pipetter med indre diameter på omkring 150 mikron. Og med flammepolerede spidser, der er omkring fire til fem millimeter lange.Læg en pipette med embryotestet, let parafinolie til lige over skulderpunktet. Derefter aspirere en lille luftboble og indlæs pipetten yderligere med M2 medium. Dernæst aspirere en anden luftboble.Nu, udarbejde embryoner i pipetten en bag den anden, minimere mængden af medium mellem embryoner. Finish, ved at aspirere en meget lille dråbe parafin olie kun et foster bred. Forberedelse af reimplantation pipetten er nøglen og har brug for en masse praksis.Æg i pipetten skal justeres med praktisk talt ingen medium i mellem dem. Dernæst efter bedøvelse af musen og bekræfter anæstesi med en tå knivspids Barbering off to, to centimeter strimler af hår langs rygmarven på niveau med den sidste ribben. Nu placere musen på en varmepude på en steril mark og drapere det, efterlader et vindue til den udsatte hud.Dernæst desinfærere den eksponerede hud med skiftevis scrubs af iodoprovidon og 70 procent ethanol. For implantation, først foretage en en centimeter tværgående snit, og derefter skubbe huden sideom side om side, indtil den orange farvede æggestir er synlig gennem kroppen væggen. Dernæst lave en fem millimeter snit med den fine saks og afhente fedt pad med en atraumatisk bulldog klemme.Når puden er grebet, trække æggestokkene, oviduct og toppen af livmoderen. Find derefter ampullaen og lav en hemisection med vannas saks, på oviduct-segmentet, der forbinder æggestokken med ampullaen. Derefter indføre overførsel embryopipette og skubbe æggene.Standsning ved den første luftboble, efter at æggene er blevet frigivet. Få de nødvendige materialer forberedt til at gentage proceduren på den anden oviduct. Og når den er færdig, lukke huden op med sårklip.Umiddelbart efter lukning af huden, intraperitonealy injicere smertestillende og placere dyret i recovery kammer med en 39 grader Celsius varmeelement. skærmen, indtil den er helt vågen. Transgene dyr blev genereret ved hjælp af den præsenterede metode.En høj titer lentiviral vektorer blev produceret ved hjælp af en 2,3 kilo base forstærker til Neurogenin-3 til at køre eGFP. Eller som et kontrolelement, et fragment af kromosom seks til at drive eGFP. Integration i embryoner var ret vellykket.Fra embryoner, pancreas knop var sektionsopdemet og immunostained at lede efter lokaliseret udtryk for eGFP. Over 90 procent af vektorerne, med Neurogenin-3 forstærker, udtrykt eGFP i Neurog3 udtrykke celler. Men, ingen af de integrerede kontrol vektorer udtrykt eGFP i bugspytkirtlen opløbet.Transgene integrationssteder blev evalueret ved kvantitativ PCR ved hjælp af CDX2-genet som en kontrol. Det gennemsnitlige antal integrationssteder var omkring 20 ved hjælp af Neurogenin-3 konstruktionen, eller 10 ved hjælp af kontrolkonstruktionen. Mærkeligt nok, den virale transduktion titer anvendes til Neurogenin-3 konstruere, var omkring det dobbelte af kontrol vektor.Tyder på en sammenhæng mellem transduktion titer og antallet af integrationer. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man kan generere et stort antal grundlægger transgene embryoner ved hjælp af perivitelline injektion af lentiviral vektorer med høj effekt. Når mestrer, denne teknik kan producere op til 50 stiftende dyr inden for en enkelt dag af mikroinjektion, hvis det udføres korrekt.Efter denne procedure, andre metoder som titer pronuclear DNA injektion kan udføres, med henblik på at etablere transgene muselinjer. Glem ikke, at arbejde med lentiviral vektorer er underlagt tilladelse fra din lokale GMO udvalg. Disse vektorer kan være ekstremt farlige, og der bør altid træffes forholdsregler under denne procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Vild type Blokering af PCR Kombineret med direkte sekventering som en yderst følsom metode til påvisning af lavfrekvent somatiske mutationer

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Hurtig sletningsproduktion i svampe via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Medieret transformation af OSCAR-sletningskonstruktioner

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion og identifikation af CRISPR/Cas9-genereret gen Knockouts i Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion og oprensning af Baculovirus for genterapi ansøgning

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Et hurtigt sølv farvning protokollen muliggør enkel og effektiv påvisning af SSR markører ved hjælp af en ikke-denatureringen polyacrylamid Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-medieret genom-redigering af menneskelige svampe patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...