Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

レンチ ウイルスのベクトル生産および動物それぞれ住宅での技術支援の原稿と iVector Phenoparc ICM コアの重要な読書、マガリ ・ デュモンとローランド メローニに感謝します。この作品は、Institut Hospitalo ユニヴェルシテール ・ デ ・神経科学 Translationnelles デによって支えられたパリ、Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06 IHU-A-ICM。広報協会・ デ ・ ラング ・ フランセーズのための資金を受け取った注ぐ流動デュ Diabète et des 病気 Métaboliques (ALFEDIAM) と共同 JDRF INSERM 付与/。

動物の仕事を含むすべての手順は、倫理的な承認を受けたし、フランス研究番号 APAFIS #5094 20 16032916219274 v6 の下教育省と 05311.02 によって承認されています。PHENOPARC は、フランス農水省認定番号 B75 の下で認定されている ICM 動物施設 13 19。総合的なプロトコルでは、図1 にまとめられている正確な時間枠内で各手順を実行する必要があります。
1. 動物...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

レンチウイルスベクターここで説明した受精卵母細胞の囲卵腔注入は、収集された胚の合計数を基準にして遺伝子胚の 70% 以上が得られた形質転換の胚の生産で起因しました。この結果、以前のレポートに一貫した手順2,7,10、11,12の特異性を例証します。表 1...

1980 年にゴードンらの先駆的な仕事を示した偽妊娠マウスに着床した受精卵前核の男性のにプラスミド DNA 注入は統合トランスジェニック動物の生産をもたらすことができる、プラスミド DNA の1。トランスジェニック哺乳類が生成されることを実証では、両方の基礎科学と医療薬学研究の新規分野への道を開く、ライフ サイエンスの世界に大きな影響を与えた。過去 4 年の間、DNA マイクロインジェクション ルーチンの練習となっています。トランスジェニック マウスの膨大な数が生産されている、標準的な方法すべてのマウス系統の完全に使用可能ではないと時間のかかる戻交配2,3が必要です。他の種への応用のまま挑戦4全体の transgene の統合収量生まれた動物5の数の割合に制限されます。また、transgene の統合の効果は、前核 DNA インジェクションの貧しい全体的な利回りを説明する制限要因を表します。この点で、統合ウイルスベクター貨物に最も効率的なツールし遺伝子を統合し、こうして大幅統合収穫、遺伝子サイズ 10 kb6 を超えることのできないという唯一の制限を増加する新しい手段を提供できます。.
レンチウイルスベクター擬似エンベロープ蛋白の水疱性口内炎ウイルス (VSV) 型指定された pantropic および高度統合遺伝子伝達ツール、受精卵7を変換する使用ことができます。卵子の周囲の透明帯自然ウイルス障害とレンチ ウイルスのベクトルを伝達できるように渡される必要があります。トランスジェニック動物はマイクロ ドリルや透明帯8,9の削除後変換受精卵母細胞によって生成されています。ただし、囲卵腔に透明帯の下に注入はロイスと同僚の7で最初に定義されている受精卵を変換する最も簡単な方法のように見えます。
レンチウイルスベクターの囲卵腔注入では、生まれた動物の 70% 以上は、トランスジェニック動物の生産に高収率をことができます。このような利回りは標準的な前核DNA 注入7,10,11を使用して達成することができます最高の収量より 10 倍以上高い。この文脈では、注射の 1 つのセッションは少なくとも 50 トランスジェニック創設者 (F0) を生成します。創設者の多数は、したがって、トランスジェニック マウスの行を生成することがなく F0 マウスに対して直接遺伝子効果の表現と互換性があります。この利点は transgene 効果の迅速なスクリーニングを可能、週間以内に体内の利得と損失関数の研究を実行に特化。また、エンハンサーと転写因子11,12によってバインドされている DNA モチーフをマップする調節 DNA 配列することができます急速に上映されるも。前核の注射で遺伝子は通常ユニークな軌跡の複数コピーを統合します。レンチ ウイルスのベクトル統合は軌跡10,13あたり単一コピーとして多遺伝子座で発生します。したがって、統合遺伝子座の多様性より堅牢な新しい生成モデルを作るトランスジェニック創設者にみられる非常に高い式浸透に関連付けられている可能性が最も高いです。
重要なは、DNA の前核の注入を使用して、プロシージャの間に前核の可視化は絶対に必要があります。この技術的な制限は、多種多様なマウス系統から受精卵の使用を防止します。したがって、特定のトランスジェニック モデルの生産目的のマウスの遺伝子を転送する少なくとも 10 連続戻交配続いて寛容ひずみにおける動物の生産を要求するどの前核が表示されないためにのひずみひずみ。レンチウイルスベクター注射囲卵腔が表示常に、注射は非常に特定のスキルを必要はありません。例として、前核注入に適さない NOD/SCID トランスジェニック マウス ウイルスベクター注射14得られています。
ここでは、包括的なプロトコルが 1 つのセル段階の胚の囲卵腔注射レンチウイルスベクターを用いた遺伝子改変マウスの簡単な生産を許可するように表示されます。遺伝子発現のいずれかで制御ユビキタスまたはセル特定のプロモーターで詳しく説明します。
PTrip ΔU3 レンチ ウイルスのバックボーンは、この研究は15で使用されました。このベクター U3 シーケンスを U3 プロモーター活性を外し、自己不活化ベクトル (罪)16を生成する部分的に削除されているレプリケーション欠陥レンチウイルスベクターを作り出すことができます。P8.91 カプセル化プラスミド (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6、水胞性口炎ウイルス (VSV) 糖 G17、および pTRIP ΔU3 のエンコーディング pHCMV G と HEK 293 t 細胞のトランスフェクションによって生産されたレンチウイルスベクター株式組換えのベクトル。詳細な運用手順は、補足的なメソッドとして提供されます。
高価レンチウイルスベクターの在庫の生産、バイオ セーフティ レベル II 条件 (BSL-2) の下で実行されます。これは BSL 3 で生産されなければならない遺伝子を除いてほとんど transgenes に当てはまります。したがって、ほとんどの場合のための BSL 2 条件での生産は十分です。さらに、使用と生産は、遺伝子組み換え作物 (GMO) を扱うほとんどの国の規制当局の切断されます通常。(P24 キャプシド蛋白質の 2 μ g) の下に複製無能な罪レンチウイルスベクターの限られた量は、欧州連合推奨事項に従ってフランス GMO 代理店によって前述の BSL 1 条件下で使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

ほぼ 40 年間は、前核 DNA 注入はトランスジェニック マウスに遺伝子のランダムな統合を生成する標準的な方法を表します。このようなルーチンの手順が世界中で広く利用されて、transgene の統合の創設者動物の低収量の結果の悪い効果の主な制限が存在します。注入された受精卵の着床後に生まれた動物の数パーセントしか遺伝子を統合しています。対照的に、レンチウイルスベクターは統合的な遺伝子導入のための強力なツールをヘッジホッグ受精卵の使用により、創設者の高効率生産 70% 以上の平均収量を持つトランスジェニック マウス。さらに、遺伝子組換え動物を生成する任意のマウスの緊張を使用ことができますおよび遺伝子発現の浸透度がきわめて高く、DNA マイクロインジェクションに比べてレンチウイルスベクターを介した遺伝子導入で 80% 以上。レンチウイルスベクターによって貨物をすることができます DNA のフラグメントのサイズは 10 kb に制限されている、このメソッドの主要な制限を表します。シンプルで簡単に受精卵の透明帯の下に注入の手順を実行を使用して、50 以上の創設者動物はマイクロインジェクションの単一のセッションで生成できます。このようなメソッドは、創設者動物、急速な利得と損失関数学または画面ゲノム DNA 領域の制御および遺伝子発現生体内で調整する機能のために直接実行する高い適応です。

トランスジェニック動物は、ここで提示されたプロトコルを使用して生成されました。代表の結果両方のユビキタスと細胞タイプ特定の遺伝子発現を示します。
導入遺伝子の発現
ユビキタスのプロモーターは、持続的かつ効率的な方法で遺伝子を表現する基本的?...

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Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

ここでは、受精卵母細胞の囲卵腔のレンチウイルスベクターの単純な注射によって transgene の統合および創設者トランスジェニック マウスに高効率の生産を促進するためにプロトコルを提案する.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

この方法は、マウスにおける迅速なインビボスクリーニングを可能にし、トランスジーンの効果を、機能のゲインまたは喪失の研究、ならびに回答およびDNA動機マッピングを行うように特異的に適合される。この技術の主な利点は、トランスジェニック動物の予測使用が新生児の70%を超え、トランスジェニック動物を含む任意のマウス株に適用できることである。マウスを安楽死させた後、卵管を収集します。手術を開始するには、はさみを使用して腹腔に大きな水平切開を行います。次に、子宮と卵巣の間の卵管を見つける。次に、湾曲した鉗子を使用して、顕著な血管を有するメソームトリウムおよび膜を除去する。次いで、卵巣から卵管を分離し、卵巣から卵管を解剖する。その後、卵管を引っ張り、子宮から切り離します。収集した卵管をすべて室温でM2培地に移します。卵管を扱うときは、受精卵を積んだ腫れたアンペアに触れないように注意してください。次に、10センチメートルの皿にヒアルロンジダーゼの働く溶液の100マイクロリットルの滴を加えます。次に卵から卵細胞を取り除いて、2つの卵性を移します。実体顕微鏡では、アンペアを引き裂き、受精卵を分散させながら、インスリン注射器を使用して卵性を確保します。次に、準備したガラスピペットとチューブとマウスピースを使用して、すべての卵を吸引します。このツールを使用して、M2培地の6滴の間でそれらを転送し、周囲の積雲細胞を洗い流します。次いで、洗浄した卵を10ミリメートルウェルに移し、4つのウェルプレートに、M16で予熱して充填した。その後、加湿37度のインキュベーターに皿を移します。調製のため、160gで調製したレンチウイルスベクター懸濁液を2分間遠心分離し、レンチウイルスストックにしばしば存在する破片をペレット化する。クラス2の安全キャビネットで、上清を新しい0.5ミリリットルチューブに移します。次に、1マイクロリットルの上清を注入ピペットにロードする。次に、射出ピペットを右側のマイクロプロイターに取り付けます。そして、左側のマイクロマニピュレータに保持ピペットを取り付けます。今、うつ病スライドの中央にM2培地の8マイクロリットルを分配します。そして、蒸発を避けるために軽いパラフィン油で覆います。その後、泡を作成することなく、ドロップ内の浅い場所に20個の卵を置きます。次に、注入ピペットの先端が開いていることを確認します。それがない場合は、それを開くために保持ピペットで注入ピペットをタップします。次に、マイクロインジェクターを20秒間注射に設定する。さて、保持ピペットと手動圧力吸引を使用して、2つの前核と2つの極体を含む受精卵。次に、卵のペリビテリン空間を注入する注入ピペットを使用する。プラズマ膜に触れないでください。ペリビテリン空間が溶液で満たされるように圧力を調整します。圧力は600ヘクトパスカルを超えてはなりません。20個の卵を注入した直後に、予熱したM16培地の浴にバッチを移す。そして、それらを移植する前に、少なくとも30分間インキュベートします。精管切除術を伴う男性に正常な女性を交配してから16時間後、交尾プラグを確認してください。移植のためにこれらの女性を使用してください。次に、約150ミクロンの内径で注入ピペットを作ります。そして、約4〜5ミリメートルの長さである炎で磨かれた先端を持つ。テストした胚でピペットをロードし、軽いパラフィンオイルを肩のポイントのすぐ上にします。次いで、小さな気泡を吸引し、さらにM2培地でピペットをロードする。次に、第2の気泡を吸引する。さて、胚をピペットの1つをもう一方の後ろに引き出し、胚間の媒体の体積を最小限に抑える。仕上げ、ちょうど1つの胚幅のパラフィン油の非常に小さな滴を吸引することによって。再着床ピペットの調製は重要であり、多くの練習が必要です。ピペットの卵は、その間に実質的に媒体なしで整列する必要があります。次に、マウスを麻酔し、つま先のピンチで麻酔を確認した後、最後の肋骨のレベルで脊髄に沿って2センチメートルの髪のストリップを剃る。今、無菌フィールドの加熱パッドの上にマウスを置き、露出した皮膚に窓を残して、それをドレープします。次に、ヨドプロビトンと70%エタノールの交互スクラブで露出した皮膚を消毒する。移植の場合は、まず1センチメートルの横切り切開を行い、オレンジ色の卵巣が体壁を通って見えるまで皮膚を横方向にスライドさせます。次に、細かいはさみで5ミリメートルの切開を行い、外傷性ブルドッグクランプで脂肪パッドを拾います。パッドがつかまれたら、卵巣、卵管、子宮の上部を引き出します。次に、アンペアを見つけ、卵巣をアンペアにリンクする卵管セグメント上に、バンナシサミでヘミセクションを作ります。次いで、移入胚ピペットを導入し、卵を排出する。卵が放出された後、最初の気泡で停止します。第2の卵管上の手順を繰り返すために準備する必要な材料を持っています。そして、完成したら、傷ついたクリップで皮膚を閉じます。皮膚を閉じた直後に、腹腔内に鎮痛薬を注入し、39度の摂氏発熱体を備えた回復室に動物を入れる。完全に起きるまで監視します。トランスジェニック動物は、提示された方法を用いて生成した。高力素レンチウイルスベクターは、eGFPを駆動するためにニューロゲニン-3のための2.3キロベースエンハンサーを使用して生成されました。またはコントロールとして、eGFPを駆動する染色体6の断片である。胚への統合はかなり成功した。胚から、膵臓芽を切除し、免疫染色してeGFPの局所的発現を探す。ベクターの90%以上は、ニューロゲニン-3エンハンサーを用いて、Neurog3発現細胞においてeGFPを発現した。しかし、膵臓芽においてeGFPを発現する統合制御ベクターはいずれもない。トランスジーン集積部位を定量PCRにより評価し、CDX2遺伝子をコントロールとして用いた。統合部位の平均数は、ニューロゲニン-3構成体を用いて約20個、または対照構造を使用して10であった。不思議なことに、ニューロゲニン-3構築物に使用されるウイルス伝達用のトイターは、対照ベクターの約2倍であった。伝達価器と積分数との関係を示唆する。このビデオを見た後, 高い有効性を持つレンチウイルスベクターのペリビテルリン注射を使用して創始者トランスジェニック胚の多数を生成する方法をよく理解する必要があります。.一度習得すると、この技術は、それが適切に実行されている場合、マイクロインジェクションの1日以内に最大50の創設者動物を生成することができます。この手順に従って、細胞間プロ核DNA注入のような他の方法を、トランスジェニックマウスラインを確立するために行うことができる。レンチウイルスベクターの操作は、地元のGMO委員会からの承認を受けることを忘れないでください。これらのベクトルは非常に危険であり、この手順を実行する間は常に予防措置を講じる必要があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

真菌による迅速な欠失生産<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt; OSCAR削除コンストラクトの仲介された変換

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

高速銀染色プロトコルを有効にする簡単なと非変化のポリアクリルアミドゲルを用いた SSR マーカーの効率的な検出

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

レンチウイルス媒介トランスジェニックマウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法