Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

우리 마 갈리 Dumont와 롤란도 Meloni lentiviral 벡터 생산 및 동물 각각 주택 기술 지원에 대 한 원고와 iVector 및 Phenoparc ICM 코어의 중요 한 독서에 대 한 감사. 이 작품은 인 Hospitalo 대학 드 신경 과학 Translationnelles 드에 의해 지원 되었다 파리, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. 협회 드 언어 프랑스에 대 한 자금 지원을 받은 홍보 부 l'Etude du Diabète 동부 표준시 데스 외관 Métaboliques (ALFEDIAM)와 공동 JDRF INSERM 부여 /.

동물 작업을 포함 하는 모든 절차 윤리적인 승인을 얻은 및 번호 APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 교육과 연구의 프랑스 내각 및 05311.02에 의해 승인 되었습니다. PHENOPARC는 인증 번호 B75 프랑스 농림에 의해 공인 된 ICM 동물 시설 13 19. 전체 프로토콜 그림1에서에서 요약 된 정확한 시간 프레임 내에서 각 절차를 수행 해야 합니다.
1. 동물 구입과 기본적인 화합물의...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

여기서 설명 하는 수정 된 oocytes에서 lentiviral 벡터의 perivitelline 주입 수집 된 배아의 총 수를 기준으로 유전자 변형 태아의 70% 이상 생성 하는 유전자 변형 태아의 생산 귀착되는. 이 결과 이전 보고서와 일치 하 고 절차2,7,10,,1112의 특이성을 단적으로 보여준다. 표 1</str...

1980 년에 고 든 외 의 선구적인 작품 pseudopregnant 마우스에 이식 후 수정 된 oocytes의 남성 pronuclei 에 플라스 미드 DNA 주입 통합 유전자 변형 동물의 생산 얻을 수 있습니다 보여주었다는 플라스 미드 DNA1. Transgenic 포유류를 생성할 수 있습니다 데모 모두 기본적인 과학 및 변환 생물 의학 연구의 새로운 분야에 길을 열어 글로벌 생명과학에 엄청난 영향을 했다. 지난 4 년간 DNA microinjection은 일상적인 연습 되었다. 유전자 변형 쥐의 거 대 한 수 제작 되었습니다, 하지만 표준 방법 모든 마우스 긴장에 대 한 완벽 하 게 사용할 수 이며 시간이 소요 backcrosses2,3를 요구 한다. 다른 종에의 응용 도전4 유적과 전반적인 transgene 통합 수익률 태어난된 동물5의 몇 %로 제한 됩니다. 또한, transgene 통합의 효능 pronuclear DNA 주입의 가난한 전체 수익률을 설명 하는 제한 요소를 나타냅니다. 이 점에서 통합 바이러스 성 벡터 화물을 가장 효율적인 도구 transgenes 통합 그리고 이렇게 크게 증가 통합 수확량, 유일한 제한은 transgene 크기를 10 kb6 초과할 수 없습니다 되 고 새로운 의미를 제공할 수 있습니다. .
Lentiviral 벡터 의사 봉투 단백질 Vesicular 구내 염 바이러스 (VSV)의 형식의 pantropic 및 높은 통합 유전자 전송 도구 이며 transduce 수정 된 oocytes7을 사용할 수 있습니다. Zona pellucida 는 oocytes를 둘러싼 자연 바이러스 방 벽 고 lentiviral 벡터와 변환 있도록 전달 될 필요 합니다. 유전자 변형 동물 마이크로 드릴링 또는 zona pellucida8,9의 제거 후 수정 된 oocytes 시험에 의해 생성 된 것. 그러나, zona pellucida perivitelline 공간에서 아래 주입 transduce 로이스와 동료7에서 처음 설명한 대로 수정 된 달걀을 간단한 방법으로 나타납니다.
Lentiviral 벡터의 perivitelline 주입 태어난된 동물의 70% 이상 유전자 변형 동물의 생산에 높은 수율을 수 있습니다. 이러한 수익률 표준 pronuclei DNA 주입7,,1011를 사용 하 여 얻을 수 있는 최고의 수익률 보다 10 배 이상 높습니다. 이러한 맥락에서 주사의 단일 세션 50 유전자 변형 설립자 (F0)를 생성 합니다. 설립자의 다 수는, 그러므로, F0 생쥐 유전자 변형 마우스 라인을 생성 하는 필요 없이 직접 수행 transgene 효과의 형질과 호환. 이 장점은 transgene 효과의 신속한 심사 가능 하며 특히 적응 주 이내 vivo에서 이득과 손실의 기능 연구를 수행 하는. 또한, 규제 DNA 요소 수 있습니다 또한 빠르게 상영 지도 강화 및 녹음 방송 요인11,12으로 DNA 주제에. Pronuclear 주사와 transgenes는 일반적으로 독특한 소재 시로 여러 복사본 통합. Lentiviral 벡터와 통합 로커 스10,13당 단일 복사본으로 여러 loci에서 발생합니다. 따라서, 통합된 loci의 다양성 유전자 변형 설립자에서 관찰은 새로운 생성 된 모델을 더 강력한 시키는 매우 높은 식 penetrance에 관련 된 가장 가능성이 높습니다.
중요 한 것은, DNA의 pronuclear 주입을 사용 하 여, 절차 동안 pronuclei 의 시각화는 절대적으로 필요 합니다. 이 기술적 제한 수정 된 oocytes 마우스 긴장의 큰 다양성에서 발생의 사용을 방지 합니다. 따라서, 특정에서 유전자 변형 모델의 생산 뒤에 적어도 10 연속 backcrosses 원하는 마우스 transgene 전송 허용 스트레인에 동물의 생산을 필요는 pronuclei 표시 되지 않습니다 변형 스트레인입니다. Lentiviral 벡터 주사 perivitelline 공간은 항상 표시와 주사 매우 구체적인 기술이 필요 하지 않습니다. 예를 들어, pronuclei 주입에 적합 하지 않은 끄 덕/SCID 유전자 변형 쥐 바이러스 성 벡터 주사14로 얻은 되었습니다 있다.
여기, 포괄적인 프로토콜 lentiviral 벡터 주사 한 세포 단계 태아의 perivitelline 공간에를 사용 하 여 유전자 변형 마우스의 간단한 생산을 허용 하도록 제공 됩니다. Transgene 식으로 제어 유비 쿼터 스 또는 셀 특정 발기인 자세하게 설명 됩니다.
PTrip ΔU3 lentiviral 백본15이 연구 사용 되었다. 이 벡터는 U3 시퀀스 부분적으로 삭제 된 U3 발기인 활동을 제거 하 고16자기 inactivating 벡터 (죄) 생성 하는 복제 결함 lentiviral 벡터를 생산 수 있습니다. Lentiviral 벡터 주식 p8.91 캡슐화 플라스 미드 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G 인코딩 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 당단백질-G17및 pTRIP ΔU3와 HEK 293T 세포의 과도 transfection에 의해 제작 재조합 벡터입니다. 자세한 생산 절차 보완 방법으로 제공 됩니다.
생산의 높은 titer lentiviral 벡터 주식 Biosafety 수준 2 세 조건 (BSL-2)에서 수행 됩니다. 이 BSL-3에서 생산 해야 oncogenes 제외한 대부분 transgenes 마찬가지입니다. 따라서, 대부분의 경우 BSL-2 조건에서 생산은 충분 합니다. 또한, 사용 및 생산 일반적으로 끊어집니다 유전자 변형된 생물체 (GMO)을 다루는 대부분 국가 규제 기관에 대 한. 제한 된 양의 복제 무능 한 죄 lentiviral 벡터 (p24 capsid 단백질의 2 µ g) 아래 유럽 연합 권고와 프랑스 조합에 의해 설명 된 대로 BSL-1 조건에서 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

거의 40 년 동안, pronuclear DNA 주입 transgenes의 임의의 통합 유전자 변형 쥐를 생성 하는 표준 메서드를 나타냅니다. 일상적인 절차는 전 세계에 걸쳐 널리 활용 하 고 그것의 주요 제한은 transgene 통합, 설립자 동물의 낮은 수율 결과의 가난한 효능에 있는. 주입 된 수정 된 oocytes의 이식 후 동물의 몇 %만는 transgene를 통합 했습니다. 반면, lentiviral 벡터 통합 유전자 이동에 대 한 강력한 도구 이며 transduce 수정 된 oocytes를 그들의 사용 허용 설립자의 고효율 생산 70% 이상 평균 수확량을 가진 유전자 변형 쥐. 또한, 모든 마우스 변형 유전자 변형 동물을 생산 하기 위해 사용할 수 있습니다 이며 transgene 표현의 penetrance lentiviral 중재 transgenesis DNA microinjection에 비해 80% 이상의 매우 높은. Lentiviral 벡터에 의해 화물을 될 수 있는 DNA 조각의 크기 10 kb로 제한 하 고이 방법의 주요 한계를 나타냅니다. 간단 하 고 쉽게 수정 된 oocytes의 zona pellucida 아래 주입 절차를 수행 하려면 사용 하 여, 50 개 이상의 설립자 동물 microinjection의 단일 세션에서 생산 수 있습니다. 이러한 메서드는 설립자 동물, 신속한 이득 및 손실 함수 연구 또는 자신의 능력을 제어 하 고 진 식에 vivo에서규제에 대 한 화면 genomic DNA 영역에서 직접 수행에 매우 적응.

유전자 변형 동물 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 되었다. 대표 결과 모두 유비 쿼터 스 그리고 셀 형식 특정 transgene 식 설명 된다.
Transgenes 제정 표현
유비 쿼터 스 발기인은 transgenes는 지속적이 고 효율적인 방식으로 표현에 기초 연구 도구입니다. 이러한 ...

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Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

이 방법은 마우스에서 빠른 생체 내 스크리닝을 허용하고, 변형유전자의 효과, 특히 기능 연구의 이득 또는 손실을 수행하기 위해 특별히 적응, 뿐만 아니라 대답과 DNA 동기 매핑. 이 기술의 주요 장점은, 형질 전환 동물의 예측 사용이 신생아의 70 % 이상이며 형질 전환 동물을 포함한 모든 마우스 균주에 적용 될 수 있다는 것입니다. 마우스를 안락사한 후, 배관을 수집합니다.수술을 시작하려면 가위를 사용하여 복강으로 큰 수평 절개를 하십시오. 그런 다음 자궁과 난소 사이의 oviduct를 찾습니다. 다음으로, 구부러진 집게를 사용하여 저명한 혈관을 가진 심술과 막을 제거하십시오.그런 다음 난소에서 oviduct를 분리하고 난소에서 oviduct를 해부합니다. 그런 다음, oviduct에 잡아 당기고 자궁에서 잘라. 수집된 모든 oviducts를 실온에서 M2 배지로 전송합니다.oviducts를 취급할 때, 기름지게 한 계란으로 가득 찬 부은 암풀라를 만지지 않도록 주의하십시오. 다음으로 10cm 접시에 히알루로니다제 작동 용액 100 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 그런 다음 두 개의 배관을 전달하여 계란에서 적수 세포를 제거합니다.스테레오 현미경으로, 암풀라를 찢고 수정란을 분산하는 동안 oviduct를 확보하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 그런 다음 튜빙과 마우스피스가 있는 준비된 유리 파이펫을 사용하여 모든 계란을 흡입합니다. 이 도구를 사용하여, 주변 적혈구세포를 씻어 M2 배지의 6 방울 사이에 전송.그런 다음, 씻은 계란을 M16로 예열 된 4 개의 우물 접시에 10 밀리미터로 옮겨 넣습니다. 그런 다음 접시를 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터로 옮기습니다. 준비과정에서, 제조된 렌티바이러스 벡터 서스펜션을 2분 동안 160g에서 원심분리하여 렌티바이러스 스톡에 종종 존재하는 잔해를 펠렛한다.클래스 2 안전 캐비닛에서, 새로운 0.5 밀리리터 튜브에 슈퍼 네이티퍼를 전송합니다. 다음으로, 1개의 마이크로리터의 상피리터를 주입 파이펫에 넣습니다. 그런 다음, 사출 파이펫을 오른쪽 미세 조작기에 부착합니다.그리고 좌측 마이크로 조작기에 홀딩 파이펫을 부착합니다. 지금, 우울증 슬라이드의 중심에 M2 배지의 8 마이크로 리터를 분배. 그리고 증발을 피하기 위해 가벼운 파라핀 오일로 덮습니다.그런 다음 거품을 만들지 않고 20 개의 계란을 방울의 얕은 위치에 놓습니다. 다음으로, 사출 파이펫의 끝이 열려 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그것을 열 지 주 파이펫주사 파이펫을 누릅니다.그런 다음 20 초 주사에 대한 마이크로 인젝터를 설정합니다. 이제, 지주 파이펫과 수동 압력을 사용하여 두 개의 프로핵과 두 개의 극성 몸을 포함하는 수정란을 흡습합니다. 이어서, 주사 피펫을 사용하여 계란의 계각 공간을 주입한다.플라즈마 멤브레인을 만지지 마십시오. 인식 공간이 용액으로 채워지되도록 압력을 조정합니다. 압력은 600 헤토 파스칼을 초과해서는 안됩니다.20개의 계란을 주입한 직후, 예열된 M16 배지의 목욕으로 배치를 옮기. 그리고 이식하기 전에 적어도 30 분 동안 배양하십시오. 16 정절과 남성에 일반 여성을 짝짓기 후, 교합 플러그를 확인합니다.이식을 위해 이 암컷을 사용하십시오. 다음으로, 약 150 미크론의 내부 직경이식 파이펫을 확인합니다. 그리고 약 4 ~ 5 밀리미터 길이의 불꽃 광택 팁.배아 테스트, 가벼운 파라핀 오일을 어깨 지점 바로 위에 로드합니다. 그런 다음, 작은 기포를 흡인하고 M2 매체로 파이펫을 추가로 적재한다. 다음으로, 두 번째 기포를 흡인.지금, 배아를 다른 뒤에 파이펫으로 그려 배아 사이 매체의 양을 최소화합니다. 마무리, 파라핀 오일의 매우 작은 방울을 흡입하여 단지 하나의 배아 폭. 재이식 파이펫의 준비는 핵심이며 많은 연습이 필요합니다.파이펫에 있는 계란은 그들 사이에 있는 실질적으로 어떤 매체와도 정렬되어야 합니다. 다음으로, 마우스를 마취하고 발가락 핀치로 마취를 확인한 후 마지막 갈비뼈 수준에서 척수를 따라 두 센티미터의 머리카락을 면도합니다. 이제, 멸균 필드에 가열 패드에 마우스를 놓고 노출 된 피부에 창을 떠나, 그것을 드레이프.다음으로, 이오도프로비돈의 번갈아 스크럽과 70%의 에탄올로 노출된 피부를 살균합니다. 이식의 경우 먼저 1센티미터의 횡반 절개를 한 다음 주황색 난소가 바디 벽을 통해 볼 때까지 피부를 측면으로 밀어 내십시오. 다음으로, 미세 한 가위로 5 밀리미터 절개를하고 외상성 불독 클램프로 지방 패드를 집어 들십시오.패드가 잡히면 난소, oviduct 및 자궁 상단을 당깁니다. 다음으로, 암풀라를 찾아 난소와 암풀라를 연결하는 oviduct 세그먼트에 반나스 가위를 가진 중간 을 만듭니다. 그런 다음, 전달 배아 파이펫을 소개하고 계란을 배출한다.계란이 방출 된 후 첫 번째 기포에서 중지합니다. 두 번째 oviduct에 절차를 반복하기 위해 필요한 재료를 준비해야합니다. 그리고 완료되면 상처 클립으로 피부를 닫습니다.피부를 닫은 직후, 복막증을 주입하고 39섭씨 가열 요소로 동물을 회복실에 놓습니다. 완전히 깨어날 때까지 모니터링합니다. 형질전환동물은 제시된 방법을 사용하여 생성되었다.높은 티터 렌티바이러스 벡터는 eGFP를 구동하는 Neurogenin-3에 대한 2.3 킬로 베이스 증강을 사용하여 생산되었다. 또는 대조군으로서, eGFP를 구동하기 위해 염색체 6의 조각. 배아에 대한 통합은 상당히 성공적이었습니다.배아에서 췌장 싹은 eGFP의 국소적 발현을 찾기 위해 단면화되고 면역 염색되었다. 뉴로인-3 증강제와 벡터의 90% 이상, Neurog3 발현 세포에 eGFP를 표현했다. 그러나, 췌장 싹에서 eGFP를 발현하는 통합 제어 벡터는 없다.트랜스진 통합 부위는 CDX2 유전자를 대조군으로 사용하여 정량적 PCR에 의해 평가되었다. 통합 부위의 평균 수는 Neurogenin-3 구조를 사용하여 약 20개, 또는 대조군 구조를 이용하여 10개였다. 호기심, Neurogenin-3 구조에 사용되는 바이러스 성 트랜스유도 티터는 대조군 벡터의 약 2배였다.변환 티터와 통합 수 사이의 관계를 제안합니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 높은 효능을 가진 렌즈 바이러스 벡터의 인식 주입을 사용하여 설립자 형질 성 배아의 큰 숫자를 생성하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다. 일단 마스터되면,이 기술은 제대로 수행되는 경우, 미세 주입의 하루 이내에 최대 50 설립자 동물을 생산할 수 있습니다.이 절차에 따라, titer 프로핵 DNA 주입 같은 다른 방법은 형질전환 마우스 라인을 설정하기 위해 수행 될 수있다. 렌즈피바이러스 벡터로 작업하는 것은 해당 지역의 GMO 위원회의 승인을 받는다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 벡터는 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

연구

유전학

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산<em&gt; 아그로 박테 리움</em&gt; OSCAR 삭제 구성 요소의 중재 변환

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...