Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Vi takker Magali Dumont og Rolando Meloni for kritisk lesning av manuskriptet og iVector og Phenoparc ICM kjerner for kundestøtte i lentiviral vektor produksjon og dyr boliger henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. PR mottatt finansiering for foreningen de Langue Française hell l'Etude du Diabète et des sykdommer Métaboliques (ALFEDIAM) og en felles JDRF INSERM støtte.

Alle prosedyrer som inkluderer dyr arbeid har fått etiske godkjenning og har blitt godkjent av det franske ministeriet for forskning og utdanning under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 og 05311.02. ICM dyr anlegget PHENOPARC har blitt akkreditert av franske Landbruksdepartementet under akkreditering nummer B75 som går 13 19. Den generelle protokollen krever utføre hver prosedyre innenfor en presis tidsramme som er oppsummert i i figur 1.
1. dyr kjøp og u...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

Perivitelline injeksjon av lentiviral vektorer i befruktet oocytes beskrevet her resulterte i produksjonen av transgene embryo som gitt mer enn 70% av transgene embryo i forhold til totalt antall samlet embryoer. Dette resultatet samsvarer med tidligere rapporter og eksemplifiserer spesifisitet av prosedyren2,7,10,11,12. Når du sammenligner alle dataene som v...

Det banebrytende arbeidet til Gordon et al. i 1980 viste at etter implantasjon i pseudopregnant mus, plasmider DNA injeksjon i den mannlige pronuclei av befruktet oocytes kan gi produksjon av transgene dyr som er integrert i plasmider DNA1. Demonstrasjon at transgene pattedyr kan genereres hatt en enorm innvirkning på globale biovitenskap, åpner veien til romanen felt forskning både for basalfag og translasjonsforskning biomedisinske vitenskaper. I de siste fire tiårene blitt DNA microinjection en rutinen praksis. Selv om et enormt antall transgene mus har blitt produsert, er ikke fullt brukbare for alle mus stammer standardmetoden og krever tidkrevende backcrosses2,3. Sin søknad til andre arter er fortsatt utfordrende4 og generelle transgene integrering avkastningen er begrenset til noen få prosent av født dyr5. I tillegg representerer effekten av transgene integrering den begrensende faktoren som forklarer dårlig totale avkastningen av pronuclear DNA injeksjon. I denne forbindelse integrerende viral vektorer er de mest effektive verktøyene til Last og integrere effekter av transgener og dermed kan gi nye midler til en betydelig økning integrering avkastning, den eneste begrensningen er at transgene størrelsen ikke kan overstige 10 kb6 .
Lentiviral vektorer pseudo skrevet med konvolutt protein av Vesicular stomatitt Virus (VSV) er pantropic og svært integrerende genet overføring verktøy og kan brukes til å transduce befruktet oocytes7. Den zona pellucida rundt oocytes er en naturlig virus barriere og må sendes for å tillate signaltransduksjon med lentiviral vektorer. Transgene dyr har blitt generert av transducing befruktet oocytes etter mikro-boring eller fjerning av zona pellucida8,9. Men synes injeksjon under zona pellucida inn perivitelline å være den enkleste metoden å transduce befruktede eggene som først beskrevet av Lois og kolleger7.
Perivitelline injeksjon av lentiviral vektorer gir høy avkastning i produksjonen av transgene dyr som er over 70% av født dyr. Slike avkastning er over 10-fold høyere enn best utbytte som kan oppnås ved hjelp av standard pronuclei DNA injeksjon7,10,11. I denne sammenheng generere en enkeltøkt av innsprøytninger minst 50 transgene grunnleggerne (F0). Det store antallet grunnleggerne er derfor kompatibel med phenotyping av transgene effekten direkte utført på F0 mus uten å generere transgene musen linjer. Denne fordelen tillater rask screening av transgene effekten og er spesielt tilpasset for å utføre i vivo gevinst og tap av funksjon studier innen uker. I tillegg kan regulatoriske DNA elementer også bli raskt vist for å tilordne enhancers og DNA motiver bundet av transkripsjon faktorer11,12. Med pronuclear injeksjoner integrere effekter av transgener vanligvis som flere eksemplarer i et unikt locus. Med lentiviral vektorer skjer integrasjon i flere loci som ett eksemplar per locus10,13. Derfor er mangfoldet av integrert loci mest sannsynlig knyttet til svært høy uttrykket penetrance observert i transgene grunnleggerne, som gjør den nye genererte modellen mer robust.
Betydelig, når du bruker pronuclear injeksjon av DNA, er visualisering av pronuclei under prosedyren helt nødvendig. Denne tekniske begrensningen forhindrer bruken av befruktet oocytes fra en rekke musen stammer. Derfor produksjon av transgene modell på en bestemt belastning for hvilke pronuclei er usynlig krever produksjon av dyr i en ettergivende belastning etterfulgt av minst 10 påfølgende backcrosses overføre transgene ønsket musen belastning. Med lentiviral vektor injeksjoner, perivitelline plass er alltid synlig og injeksjon krever ikke svært spesifikke ferdigheter. Som et eksempel, er hilsen/SCID transgene musene som ikke passer i pronuclei injeksjon anskaffet med viral vektor injeksjoner14.
Her vises en omfattende protokoll for å tillate enkel produksjon av transgene mus bruke lentiviral vektor injeksjoner i perivitelline plass på en én celle scenen fosteret. Transgene uttrykk kontrollert med enten allestedsnærværende eller cellen bestemt arrangører er beskrevet i detalj.
PTrip ΔU3 lentiviral ryggraden ble brukt i denne studien15. Denne vektoren kan produsere replikering defekt lentiviral vektorer der U3 sekvensen er delvis slettet for å fjerne U3 promoter aktivitet og generere en selv inactivating vektor (SIN)16. Lentiviral vector aksjer ble produsert av forbigående transfection av HEK-293T-celler med p8.91 innkapsling plasmider (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G koding vesicular stomatitt virus (VSV) glykoprotein-G17, og pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Detaljert produksjon fremgangsmåten oppgis som supplerende metoder.
Produksjon av høy titer lentiviral vektor aksjer utføres under Biosafety nivå II forhold (BSL-2). Dette gjelder for de fleste effekter av transgener bortsett fra oncogenes som produseres i BSL-3. Produksjon i BSL-2 forhold i de fleste tilfeller er derfor tilstrekkelig. Dessuten, kobles bruk og produksjon vanligvis til de fleste nasjonale reguleringsorganer håndtere genmodifiserte organismer (GMO). Begrensede mengder replikering inkompetente synd lentiviral vektorer (under 2 µg p24 kapsid protein) kan brukes under BSL-1 forhold som beskrevet av fransk GMO byrået med EU anbefalingene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

For nesten 40 år representerer pronuclear DNA injeksjon standardmetoden generere transgene mus med tilfeldig integrering av effekter av transgener. Slike en rutinemessig prosedyre benyttes mye i hele verden og dens viktigste begrensningen ligger i dårlig effekt av transgene integrasjon, noe som resulterer i en lav avkastning grunnlegger dyr. Bare få prosent av dyr født etter implantasjon av injisert befruktet oocytes har integrert av transgene. Derimot lentiviral vektorer er kraftige verktøy for integrerende genoverføring og kunne transduce befruktet oocytes tillater svært effektiv produksjon av grunnleggeren transgene mus med en gjennomsnittlig avkastning over 70%. Videre musen belastning kan brukes til å produsere transgene dyr og penetrance av transgene uttrykk er ekstremt høy, over 80% med lentiviral mediert transgenesis sammenlignet DNA microinjection. Størrelsen på DNA fragmentet som kan Last av lentiviral vektoren er begrenset til 10 kb og representerer stor begrensning av denne metoden. Bruker en enkel og lett å utføre injeksjon prosedyren under zona pellucida av befruktet oocytes, kan mer enn 50 grunnlegger dyr produseres i én økt av microinjection. Slik metode er svært tilpasset å utføre, direkte i grunnlegger dyr, rask gevinst og tap av funksjon studier eller til skjermen genomisk DNA områder for sin evne til å kontrollere og regulere genet uttrykk i vivo.

Transgene dyr ble generert ved hjelp av protokollen som presenteres her. Representant resultater både allestedsnærværende og celle type bestemt transgene uttrykk er illustrert.
Grunnleggende uttrykk for effekter av transgener
Allestedsnærværende arrangører er grunnleggende forskningsverktøy for å uttrykke effekter av transgener i en vedvarende ...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral formidlet produksjon av transgene mus: en enkel og svært effektiv metode for direkte av grunnleggerne

Her presenterer vi en protokoll for å fremme transgene integrering og produksjon av grunnleggeren transgene mus med høy effekt ved en enkelt injeksjon av en lentiviral vektor i perivitelline løpet av et befruktet oocyte.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Denne metoden tillater rask in vivo screening hos mus, av effekten av en transgene, og er spesielt tilpasset for å utføre gevinst eller tap av funksjonsstudier, samt et svar og DNA-motiv kartlegging. Den største fordelen med denne teknikken, er at prediksjon bruk av transgene dyr er over 70% av nyfødte og kan brukes på noen mus stammer inkludert transgene dyr. Etter eutanisering av musene, samle oviducts.For å begynne operasjonen, bruk saks for å lage et stort horisontalt snitt i bukhulen. Deretter lokaliserer du oviducten mellom livmoren og eggstokken. Deretter bruker du buede tang for å fjerne mesometrium og membranen med de fremtredende blodkarene.Deretter skiller oviducten fra eggstokken og dissekerer oviducten fra eggstokken. Deretter slepe på oviduct og kuttet bort fra livmoren. Overfør alle de oppsamlede oviduktene til M2 medium ved romtemperatur.Når du håndterer oviducts, vær forsiktig med å unngå å berøre den hovne ampulla lastet med befruktede egg. Deretter legger du til en 100 mikroliter dråpe hyaluronidase arbeidsløsning til en 10 centimeter tallerken. Deretter overfører du de to oviduktene til den, for å fjerne cumuluscellene fra eggene.Under et stereomikroskop bruker du et par insulinsprøyter for å feste ovidukten mens du opp ampullaen og dispergerer de befruktede eggene. Deretter bruker du en forberedt glasspipette med rør og et munnstykke for å aspirere alle eggene. Ved hjelp av dette verktøyet, overføre dem mellom seks dråper M2 medium for å vaske av de omkringliggende cumulus celler.Deretter overfører du de vasket eggene til en 10 millimeter godt, i en fire brønnplate, fylt med forvarmet med M16. Deretter overfører du parabolen til en fuktet 37 graders Celsius inkubator. Som forberedelse, sentrifuge forberedt lentiviral vektor suspensjon på 160 g i to minutter, for å pellet rusk ofte tilstede i lentiviral lager.I et sikkerhetsskap i klasse to overfører du supernativa til et nytt 0,5 milliliter rør. Deretter laster du en mikroliter overnaturant, inn i en injeksjonpipette. Deretter fester du injeksjonspipetten til høyre mikromanipulater.Og fest holdepipetten til venstre side mikromanipulator. Nå dispenserer åtte mikroliter av M2 medium i midten av depresjonslysbildet. Og dekk med lett parafinolje for å unngå fordampning.Deretter plasserer du 20 egg i de grunne stedene i dråpen uten å lage bobler. Deretter må du kontrollere at spissen av injeksjonspipetten er åpen. Hvis ikke, trykk injeksjonspipetten med holdepipetten for å åpne den.Deretter setter du mikroinjektoren i 20 andre injeksjoner. Nå, ved hjelp av holder pipette og manuelt trykk aspirere et befruktet egg som inneholder to pronuclei og to polare kropper. Deretter, ved hjelp av injeksjon pipette injisere perivitelline plass av egget.Ikke berør plasmamembranen. Juster trykket slik at perivitelline-rommet er fylt med oppløsning. Trykket bør ikke overstige 600 hecto pascals.Umiddelbart etter injeksjon av de 20 eggene, overfør batchen til et bad med forvarmet M16 medium. Og inkuber dem i minst 30 minutter før implantering dem. 16 timer etter parring av normale kvinner til menn med vasectomies, se etter copulation plugger.Bruk disse hunnene til implantasjon. Deretter lager du implantasjonspipetter med en innvendig diameter på ca. 150 mikron. Og med flammepolerte tips som er omtrent fire til fem millimeter lange.Legg en pipette med embryotestet, lett parafinolje til like over skulderpunktet. Deretter aspirerer du en liten luftboble og laster pipetten ytterligere med M2-medium. Deretter aspirerer du en annen luftboble.Nå, trekk opp embryoene i pipetten bak den andre, og minimerer volumet av medium mellom embryoene. Fullfør, ved å aspirere en svært liten dråpe parafinolje bare ett embryo bredt. Utarbeidelse av reimplantasjonspipetten er nøkkelen og trenger mye praksis.Egg i pipetten må justeres med praktisk talt ingen medium mellom dem. Deretter, etter bedøving av musen og bekrefter anestesi med tåklemIng av to, to centimeter strimler av hår langs ryggmargen på nivået av den siste ribben. Plasser nå musen på en varmepute på et sterilt felt og draper den, og la et vindu til den eksponerte huden.Deretter renser du den eksponerte huden med vekslende skrubb av iodoprovidon og 70 prosent etanol. For implantasjonen, først gjøre en en centimeter tverrgående snitt, og deretter skyve huden sideveis til den oransje farget eggstokk er synlig gjennom kroppsveggen. Deretter gjør en fem millimeter snitt med den fine saksen og plukke opp fett puten med en atraumatisk bulldog klemme.Når puten er grepet, trekk ut eggstokken, ovidukten og toppen av livmoren. Deretter finner du ampullaen og lager en hemiseksjon med vannassakse, på oviductsegmentet som knytter eggstokken til ampulla. Deretter introduserer overføringsembryopipetten og kaster ut eggene.Stopper ved den første luftboblen etter at eggene er sluppet ut. Har de nødvendige materialene forberedt på å gjenta prosedyren på den andre oviducten. Og når den er ferdig, lukk huden med sårklips.Umiddelbart etter å ha lukket huden, injiser intraperitonealy smertestillende og legg dyret i gjenopprettingskammeret med et 39 graders Celsius-varmeelement. Monitor til den er helt våken. Transgene dyr ble generert ved hjelp av den presenterte metoden.En høy titer lentiviral vektorer ble produsert ved hjelp av en 2,3 kilo base enhancer for Neurogenin-3 å kjøre eGFP. Eller som en kontroll, et fragment av kromosom seks å drive eGFP. Integrering i embryoer var ganske vellykket.Fra embryoene ble bukspyttkjertelknoppen seksjonert og immunostet for å lete etter lokalisert uttrykk for eGFP. Over 90 prosent av vektorene, med Neurogenin-3 enhancer, uttrykte eGFP i Neurog3 som uttrykte celler. Men ingen av de integrerte kontrollvektorene uttrykte eGFP i bukspyttkjertelen knoppen.Transgene integrasjon nettsteder ble evaluert av kvantitative PCR, ved hjelp av CDX2 genet som en kontroll. Gjennomsnittlig antall integreringssteder var ca 20 ved hjelp av Neurogenin-3-konstruksjonen, eller 10 ved hjelp av kontrollkonstruksjonen. Merkelig, den virale transduksjon titer som brukes for Neurogenin-3 konstruksjon, var omtrent dobbelt av kontroll vektor.Foreslår en sammenheng mellom transduksjonstitre og antall integrasjoner. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du genererer et stort antall grunnleggertransgene embryoer ved hjelp av perivitellin injeksjon av lentiviral vektorer med høy effekt. Når mestret, denne teknikken kan produsere opptil 50 grunnleggerdyr innen en enkelt dag av mikroinjeksjon, hvis det er utført riktig.Etter denne prosedyren kan andre metoder som titer pronukleær DNA-injeksjon utføres, for å etablere transgene muselinjer. Ikke glem at det å jobbe med lentiviralvektorer blir utsatt for autorisasjon fra din lokale GMO-komité. Disse vektorene kan være ekstremt farlige og forholdsregler bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Produksjon i Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produksjon og rensing av Baculovirus for genterapi program

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

En rask sølv flekker protokollen muliggjør enkel og effektiv deteksjon av SSR markører bruker en ikke-denaturing polyakrylamid Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediert genomet redigering av Human Fungal patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...