Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Мы благодарим Магали Дюмон и Роландо Мелони для критических чтении рукописи и iVector и Phenoparc ядер ICM для оказания технической помощи в производстве лентивирусные вектор и животных жилья соответственно. Эта работа была поддержана нейронаук де Hospitalo-Университетский институт Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, будущее Investissements АНР-10-IAIHU-06. P.R. получил финансирование ассоциации де Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) и совместных JDRF / INSERM гранта.

Все процедуры, которые включают животных работы получили этические утверждения и было санкционировано французского министерства научных исследований и образования под номером #5094-20 APAFIS 16032916219274 v6 и 05311.02. ICM животных фонда PHENOPARC была аккредитована Министерством сельского хозяйства Фра?...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы в оплодотворенных яйцеклеток, описанные здесь в результате производства трансгенных эмбрионов, которые принесли более чем 70% эмбрионов трансгенных относительно общее количество собранных эмбрионов. Этот результат согласуется с предыдущим...

Новаторскую работу Гордон et al. в 1980 году показал, что после имплантации в pseudopregnant мышей, плазмида ДНК инъекции в мужской pronuclei оплодотворенных яйцеклеток может принести производства трансгенных животных, которые интегрированы плазмида ДНК1. Демонстрация, что могут быть получены трансгенные млекопитающих оказали огромное воздействие на глобальные наук о жизни, открыв путь к Роман областях исследований, как для фундаментальных наук и трансляционная биомедицинских наук. В последние четыре десятилетия ДНК микроинъекции стало обычной практикой. Хотя огромное количество трансгенных мышей были произведены, стандартный метод не является полностью пригоден для всех штаммов мыши и требует много времени беккроссов2,3. Его применение в отношении других видов остается сложной4 и урожайность трансген интеграции ограничивается несколько процент род животных5. Кроме того эффективность интеграции трансген представляет сдерживающим фактором, который объясняет бедных урожайность pronuclear ДНК инъекции. В этой связи интегративной вирусных векторов являются наиболее эффективные инструменты для груза и интегрировать трансгенов и таким образом может предоставить новые средства для значительного увеличения урожайности интеграции, единственное ограничение в том, что размер трансген, который не может превышать 10 КБ6 .
Лентивирусные векторы псевдо-типизированных с конверт белков вируса везикулярного стоматита (ВСВ) являются инструментами передачи pantropic и высоко интегративной гена и может использоваться для передают оплодотворенных яйцеклеток7. Zona pellucida окружающих яйцеклеток является естественным вирус барьер и должен быть передан позволить трансдукция с лентивирусные векторы. Трансгенные животные были получены путем преобразования оплодотворенных яйцеклеток после микро бурение или удаление вителлинового8,9. Однако инъекции под вителлинового в пространстве наблюдаться, по-видимому, самый простой способ передавать оплодотворенные яйца как первоначально описано Лоис и коллеги-7.
Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы позволяет высокие урожаи в производстве трансгенных животных, которые находятся выше 70% род животных. Такая доходность свыше 10 раз выше, чем лучший доходность, которая может быть достигнута с помощью стандартных pronuclei ДНК инъекций7,10,11. В этом контексте одной сессии инъекции создаст по меньшей мере 50 основатели трансгенное (F0). Таким образом, большое количество учредителей совместим с фенотипирование эффекта трансген, непосредственно над F0 мышей без необходимости создания трансгенные мыши линии. Это преимущество позволяет для быстрого скрининга трансген эффект и специально приспособлены для выполнения в vivo выгоды и потери функции исследований в течение недели. Кроме того регулирующие элементы ДНК можно также быстро проверяться на карте усилители и ДНК мотивы связаны факторы транскрипции11,12. С pronuclear инъекции трансгенов обычно интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С лентивирусные векторы интеграция происходит в нескольких локусов одну копию за Локус10,13. Таким образом множество интегрированных локусов скорее связаны с очень высокой выражение пенетрантностью, наблюдается в трансгенных учредителей, что делает новый сгенерированной модели более надежной.
Важно отметить, что при использовании pronuclear для инъекций ДНК, визуализация pronuclei во время процедуры абсолютно необходим. Это техническое ограничение предотвращает использование оплодотворенных яйцеклеток, происходящих из разнообразных штаммов мыши. Таким образом, производство трансгенных модели в определенном напрягаться, для которых pronuclei невидимый требует производства животных в разрешительной штамм следуют по крайней мере 10 последовательных беккроссов для передачи трансген в желаемой мыши штамм. С лентивирусные вектор инъекции наблюдаться пространства всегда видна и инъекции не требует узкоспециализированных навыков. В качестве примера NOD/SCID трансгенных мышей, которые не подходят для инъекций pronuclei были получены с вирусный вектор инъекции14.
Здесь всеобъемлющий протокол представляется простой производства трансгенных мышей с использованием инъекций лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться одной ячейки стадии эмбриона. Трансген выражение, контролируемых либо с вездесущими или подробно описаны конкретные промоутеров ячейки.
PTrip ΔU3 лентивирусные костяк был использован в данном исследовании15. Этот вектор позволяет производить репликацию дефектных лентивирусные векторы, в которых последовательность U3 был частично удален чтобы удалить U3 промоутер активности и создания самостоятельной инактивирующего вектор (SIN)16. Лентивирусные вектор запасы были произведены переходных transfection клеток ГЭС 293T с p8.91 инкапсуляции плазмида (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G кодирование гликопротеин G (ВСВ) вирус везикулярного стоматита17и pTRIP ΔU3 Рекомбинатные вектор. Процедура подробно производства предоставляется в качестве дополнительных методов.
Производство высокого титра лентивирусные вектор запасов осуществляется в условиях биобезопасности уровня II (BSL-2). Это верно для большинства трансгенов за исключением онкогенов, которые должны быть произведены в BSL-3. Таким образом производство в условиях BSL-2 в большинстве случаев достаточно. Кроме того использование и производство обычно отключены для большинства национальных регулирующих органов, занимающихся генетически модифицированных организмов (ГМО). Ограниченное количество некомпетентных ГРЕХ репликации лентивирусные векторы (ниже 2 мкг белка капсид p24) может использоваться в условиях BSL-1, как описано в ГИО французского Агентства согласился с рекомендациями Европейского союза.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

Почти 40 лет pronuclear ДНК инъекций представляет собой стандартный метод для создания трансгенных мышей с случайных интеграции трансгенов. Такая обычная процедура широко используется во всем мире и его основное ограничение проживает в бедных эффективность интеграции трансген, что приводит к низкой урожайности основатель животных. Трансген включили только несколько процентов животных, родившихся после имплантации вводят оплодотворенных яйцеклеток. Напротив лентивирусные векторы являются мощными инструментами для переноса интегративной генов и их использование для передают оплодотворенной яйцеклетки позволяет высокоэффективное производство основателя трансгенных мышей с средняя урожайность выше 70%. Кроме того любой штамм мыши могут использоваться для производства трансгенных животных и пенетрантностью трансген выражение является чрезвычайно высокой, выше 80% с лентивирусные опосредованной трансгенез, по сравнению с ДНК микроинъекции. Размер фрагмента ДНК, которая может быть груз лентивирусные вектор ограничено 10 КБ и представляет собой главное ограничение этого метода. С помощью простой и легко выполнять процедуры инъекции под вителлинового оплодотворенных яйцеклеток, более чем 50 основатель животных могут быть произведены в одной сессии микроинъекции. Такой метод является очень приспособлены для выполнения непосредственно в основатель животных, быстрый выигрыш и потери функции исследований или геномной ДНК областей экрана для их способность контролировать и регулировать ген выражение в естественных условиях.

Трансгенных животных были получены с помощью протокола, представленные здесь. Представитель приводит оба повсеместно и проиллюстрированы выражения конкретных трансген типа ячейки.
Учредительный выражение трансгенов
<p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

Здесь мы представляем протокол для содействия интеграции трансген и основатель трансгенных мышей с высокой эффективности производства путем простой инъекции лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Этот метод позволяет быстро in vivo скрининга у мышей, эффект трансгена, и специально адаптированы для выполнения усиления или потери функции исследований, а также ответ и ДНК мотив картирования. Основным преимуществом этой техники является то, что прогноз использования трансгенных животных выше 70% новорожденных и может быть применен к любым штаммам мыши, включая трансгенных животных. После усыпания мышей, собирать яйцеклетки.Чтобы начать операцию, используйте ножницы, чтобы сделать большой горизонтальный разрез в брюшную полость. Затем найдите яйцеклетку между маткой и яичником. Далее используйте изогнутые типсы для удаления мезометриума и мембраны с выдающимися кровеносными сосудами.Затем отделить яйцеклетку от яичника и вскрыть яйцеклетку из яичника. Затем буксир на яйцеклетку и отрезать от матки. Перенесите все собранные яйцеклетки на М2 при комнатной температуре.При обработке овидуков, будьте осторожны, чтобы избежать прикосновения опухшие ампулы загружены оплодотворенными яйцами. Затем добавьте 100 микролитровую каплю гиалуронидазы рабочего раствора в 10-сантиметровую тарелку. Затем перенесите в него два яйцеклетки, чтобы удалить кучевые клетки из яиц.Под стереомикроскопом используйте пару инсулиновых шприцев для защиты яйцеклетки при разрыве ампулы и рассеивании оплодотворенных яйцеклеток. Затем используйте подготовленную стеклянную пипетку с трубкой и мундштук, чтобы аспирировать все яйца. Используя этот инструмент, перенесите их между шестью каплями среды M2, чтобы смыть окружающие клетки кумуля.Затем перенесите вымытые яйца в 10-миллиметровый колодец, в четырех хорошо пластины, наполненные разогретыми с M16. Затем перенесите блюдо в увлажненные 37 градусов по Цельсию инкубатор. В процессе подготовки центрифуга подготовленной лентивирусной векторной суспензии на 160 г в течение двух минут, чтобы гранулировать мусор, часто присутствующий в лентивирусном запасе.В шкафу безопасности второго класса перенесите супернатанты в новую 0,5 миллилитровую трубку. Затем загрузите один микролитер супернатанта в инъекционный пипетку. Затем прикрепите инъекцию пипетки к правой стороне микроманипулатера.И прикрепите удерживаемую пипетку к левому боковой микроманипулятору. Теперь, обойтись без восьми микролитров M2 среды в центре депрессии слайда. И накрыть легким парафинового масла, чтобы избежать испарения.Затем поместите 20 яиц в неглубоких местах в падении, не создавая пузырьков. Далее убедитесь, что кончик инъекционной пипетки открыт. Если нет, нажмите на инъекцию пипетки с удерживанием пипетки, чтобы открыть его.Затем установите микроинъектор на 20 секунд инъекций. Теперь, используя удерживая пипетку и ручное давление аспирировать оплодотворенную яйцеклетку, которая содержит два pronuclei и два полярных тела. Затем, используя инъекцию пипетки ввести перивителлин пространство яйца.Не прикасайтесь к плазменной мембране. Отрегулируйте давление так, чтобы перивильное пространство было заполнено раствором. Давление не должно превышать 600 гекто паскаля.Сразу же после введения 20 яиц, передать партию в ванну разогретой M16 среды. И инкубировать их, по крайней мере 30 минут, прежде чем имплантировать их. Через 16 часов после спаривания нормальных самок с самцами с вазэктомиями, проверьте наличие разъемов для совокупления.Используйте этих самок для имплантации. Далее сделайте имплантационые пипетки с внутренним диаметром около 150 микрон. И с пламенем полированной советы, которые около четырех до пяти миллиметров в длину.Загрузите пипетки с эмбрионом испытания, свет парафина нефти чуть выше точки плеча. Затем, аспирировать небольшой пузырь воздуха и дальнейшей загрузки пипетки со средним M2. Далее, аспирировать второй пузырь воздуха.Теперь нарисуйте эмбрионы в пипетки один за другим, минимизируя объем среды между эмбрионами. Закончите, аспирируя очень небольшую каплю парафинового масла, шириной всего один эмбрион. Подготовка реимплантации пипетки является ключевым и требует много практики.Яйца в пипетки должны быть выровнены практически без среды между ними. Далее, после обезболивать мышь и подтверждая анестезию с помощью щепотки бритья с двух, двух сантиметровых полосок волос вдоль спинного мозга на уровне последнего ребра. Теперь поместите мышь на грелку на стерильное поле и драпировать ее, оставляя окно для открытой кожи.Далее, дезинфицировать открытые кожи с чередующимися скрабы иодопродидона и 70 процентов этанола. Для имплантации сначала сделайте поперечный разрез на один сантиметр, а затем сдвиньте кожу с боковой стороны, пока яичник оранжевого цвета не будет виден через стенку тела. Затем сделайте пятимиллиметровый разрез с помощью тонких ножниц и возьмите жировую прокладку с атрауматическим бульдогом.После того, как колодка схватилась, вытащите яичник, яйцеклетку и верхнюю часть матки. Затем найдите ампулу и сделайте гемизекцию ножницами vannas, на сегменте яйцеклетки, который связывает яичник с ампулой. Затем ввести перенесите пипетки эмбриона и выбросить яйца.Остановка на первый пузырь воздуха после яйца были освобождены. Иметь необходимые материалы, подготовленные для повторения процедуры на втором яйцеклетке. И как только завершено, закрыть кожу с раны клипы.Сразу же после закрытия кожи, внутриперитонея вводили обезболивающее и помещика поместить животное в камеру восстановления с 39 градусов по Цельсию нагревательный элемент. Монитор, пока он полностью не проснется. Трансгенные животные были созданы с помощью представленного метода.Высокие лентивирусные векторы titer были произведены с использованием 2,3-килограммового базового усилителя для Neurogenin-3 для привода eGFP. Или в качестве контроля, фрагмент хромосомы шесть диск eGFP. Интеграция в эмбрионы была достаточно успешной.Из эмбрионов, почки поджелудочной железы был секционирован и иммунотонных искать локализованное выражение eGFP. Более 90 процентов векторов, с усилителем Neurogenin-3, выразил eGFP в Neurog3 экспресс-клеток. Тем не менее, ни один из интегрированных векторов контроля выразил eGFP в зародыше поджелудочной железы.Места интеграции Трансгена оценивались количественным ПЦР, используя ген CDX2 в качестве контроля. Среднее количество интеграционных объектов было около 20 с использованием конструкции Neurogenin-3, или 10 с использованием конструкции управления. Любопытно, что вирусный трансдукционный рейтер, используемый для конструкции Neurogenin-3, был примерно в два раза больше вектора контроля.Предлагая связь между трансдукционной рейтер и число интеграций. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать большое количество основателей трансгенных эмбрионов с использованием перивителлин инъекции лентивирусных векторов с высокой эффективностью. После освоения, эта техника может производить до 50 животных-основателей в течение одного дня микроинъекции, если она выполнена должным образом.После этой процедуры, другие методы, такие как titer pronuclear инъекции ДНК могут быть выполнены, для того, чтобы установить трансгенные линии мыши. Не забывайте, что работа с лентивирусными векторами подлежит разрешению местного комитета ГМО. Эти векторы могут быть чрезвычайно опасными и меры предосторожности всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Дикого типа Блокирование ПЦР в сочетании с прямым секвенированием как высоко чувствительный метод обнаружения низкочастотных соматические мутации

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Быстрое удаление продукта в грибах через<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованное преобразование конструкций удаления ОСКАР

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

ТРИФОСФАТЫ опосредованной редактирование генома человека грибкового патогена Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...