Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Vi tackar Magali Dumont och Rolando Meloni för kritisk läsning av manuskriptet och iVector och Phenoparc ICM kärnor för tekniskt bistånd i lentiviral vector produktion och djur bostäder respektive. Detta arbete fick stöd av Institut Hospitalo-Universitaire de neurovetenskap Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements pris ANR-10-IAIHU-06. P.R. fick finansiering för den förening de Langue françaisen pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) och en gemensam JDRF INSERM bevilja.

Alla rutiner som omfattar animaliska arbete erhållit etiskt godkännande och har godkänts av det franska ministeriet för forskning och utbildning under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 och 05311.02. ICM djuranläggningen PHENOPARC har ackrediterats av franska ministeriet för jordbruk under ackreditering nummer B75 13 19. Övergripande protokollet kräver utför varje förfarande inom en exakt tidsram som sammanfattas i Figur1.
1. animaliskt inköp och f?...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

Perivitelline injektion av lentiviral vektorer i befruktade oocyter beskrivs här resulterat i produktionen av transgena embryon som gav mer än 70% av transgena embryon i förhållande till totala antalet insamlade embryon. Detta resultat överensstämmer med tidigare rapporter och exemplifierar specificiteten av förfarande2,7,10,11,12. När man jämför all...

Det banbrytande arbetet av Gordon et al. 1980 visade att efter implantation i pseudopregnant möss, en plasmid DNA injektion i den manliga pronuclei befruktade oocyter kan ge produktion av transgena djur som integrerade de plasmid DNA1. Demonstrationen att transgena däggdjur kan genereras hade en enorm inverkan på global life science, öppnar vägen till nya fält av forskning både för grundläggande vetenskaper och translationell biomedicinsk vetenskap. I de senaste fyra årtiondena blivit DNA Mikroskop en rutinmässig praxis. Trots ett enormt antal transgena möss har producerats, standardmetoden är inte fullt användbara för alla mus stammar och kräver tidskrävande backcrosses2,3. Dess tillämpning på andra arter förblir utmanande4 och övergripande transgenens integration avkastningen är begränsad till några procent av födda djur5. Dessutom representerar effekten av transgenens integration den begränsande faktorn som förklarar dålig totala avkastningen av pronukleär DNA injektion. I detta avseende integrativ virala vektorer är de mest effektiva verktygen till last och integrera transgener och därmed kunde ge nya sätt att avsevärt öka integrationen avkastning, den enda begränsningen är att transgenens storlek inte får överstiga 10 kb6 .
Lentiviral vektorer pseudo skrivit med omsluta proteinet av vesikulär stomatit Virus (VSV) är pantropic och mycket integrativ gen transfer verktyg och kan användas för att transduce befruktade oocyter7. Den zona pellucida kring oocyterna är en naturlig virus barriär och måste vidarebefordras för att tillåta transduktion med lentiviral vektorer. Transgena djur har genererats av transducing befruktade oocyter efter mikro-borrning eller borttagning av zona pellucida8,9. Injektion under de zona pellucida i perivitelline utrymmet tycks dock vara det enklaste sättet att transduce de befruktade äggen som inledningsvis beskrivs av Lois och kollegor7.
Perivitelline injektion av lentiviral vektorer tillåter hög avkastning i produktionen av transgena djur som är över 70% av födda djur. Sådan avkastning är över 10 gånger högre än den bästa avkastningen som kan uppnås med hjälp av standard pronuclei DNA injektion7,10,11. I detta sammanhang kommer att en enda session injektioner generera minst 50 transgena grundarna (F0). Det stora antalet grundarna är därför kompatibla med fenotypning av transgenens effekten direkt utförs på F0 möss utan att behöva generera transgena möss rader. Denna fördel kan för snabb screening av transgenens effekten och är speciellt anpassade att utföra i vivo vinst och förlust av funktion studier inom veckor. Dessutom kan regulatoriska DNA-element också snabbt kontrolleras för att mappa smakförstärkare och DNA motiv bunden av transkription faktorer11,12. Med pronukleär injektioner integrera transgener oftast multipla kopior i en unik locus. Med lentiviral vektorer sker integration i flera loci som ett enda exemplar per locus10,13. Multiplicityen av integrerade loci är därför sannolikt associerade till de mycket höga uttryck penetrans hos transgena grundarna, vilket gör den nya genererade modellen mer robust.
Ännu viktigare, när du använder pronukleär injektion av DNA, krävs visualisering av pronuclei under förfarandet absolut. Denna tekniska begränsning förhindrar användningen av befruktade oocyter med ursprung från en stor mängd mus stammar. Därför produktionen av transgena modell i en specifik stam för vilka pronuclei är osynliga kräver produktion av djur i en tillåtande stam följt av minst 10 på varandra följande backcrosses att överföra transgenens i önskad musen stam. Med lentiviral vector injektionerna, perivitelline utrymme är alltid synliga och injektionen kräver inte mycket specifika färdigheter. Exempel har nicka/SCID transgena möss som inte är lämpliga för pronuclei injektion erhållits med viral vektor injektioner14.
Här presenteras ett omfattande protokoll för att tillåta enkel produktion av transgena möss med lentiviral vector injektioner i perivitelline rymden av ett embryo med en cell i scenen. Transgenens uttryck kontrolleras med antingen allestädes närvarande eller cell specifika initiativtagare beskrivs i detalj.
PTrip ΔU3 lentiviral ryggraden användes i denna studie15. Denna vektor kan producera replikering defekta lentiviral vektorer där sekvensen U3 delvis har raderats för att ta bort U3 arrangören aktivitet och generera en egen inactivating vektor (SIN)16. Lentiviral vector bestånd producerades av övergående transfection HEK-293T celler med p8.91 inkapsling plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodning av vesikulär stomatit virus (VSV) glykoprotein-G17, och den pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Förfarandet för detaljerad produktion tillhandahålls som kompletterande metoder.
Produktionen av hög titer lentiviral vector lager utförs på biosäkerhet nivå II villkor (BSL-2). Detta är sant för de flesta transgener utom onkogener som måste produceras i BSL-3. Produktion i BSL-2 villkor i de flesta fall är därför tillräcklig. Dessutom, kopplas användning och produktion oftast för de flesta nationella tillsynsmyndigheter som arbetar med genetiskt modifierade organismer (GMO). Begränsade mängder av replikering inkompetenta synd lentiviral vektorer (under 2 µg p24 kapsid protein) kan användas under BSL-1 förhållanden som beskrivs av byråns franska GMO i samförstånd med Europeiska unionens rekommendationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

För nästan 40 år representerar pronukleär DNA injektion standarden metod att generera transgena möss med slumpmässiga integration av transgener. Ett sådant rutinmässigt förfarande används allmänt i hela världen och dess huvudsakliga begränsning bosatt i fattiga effekten av transgenens integration, vilket resulterar i en låg avkastning av grundaren djur. Endast några procent av djur födda efter implantation av injicerade befruktade oocyter har integrerat transgenens. Däremot lentiviral vektorer är kraftfulla verktyg för integrativ genöverföring och deras användning till transduce befruktade oocyter tillåter mycket effektiv produktion av grundaren transgena möss med en genomsnittlig avkastning över 70%. Dessutom någon mus stam kan användas för att producera transgena djur och penetrans av transgenens uttryck är extremt hög, över 80% med lentiviral medierad genmodifiering jämfört DNA Mikroskop. Storleken på den DNA-fragment som kan vara last av lentiviral vektorn är begränsad till 10 kb och representerar den största begränsningen av denna metod. Använda en enkel och lätt att utföra injektionsproceduren under den zona pellucida befruktade oocyter, kan mer än 50 grundare djur produceras i en enda session av Mikroskop. En sådan metod är mycket anpassade till utföra, direkt i grundare djur, snabb vinst och förlust av funktion studier eller till skärmen genomisk DNA-regioner för sin förmåga att styra och reglera gen uttryck i vivo.

Transgena djur genererades med hjälp av protokollet som presenteras här. Representativa resultat både allestädes närvarande och cell typ specifika transgenens uttryck är illustrerade.
Konstitutiva uttryck av transgener
Allestädes närvarande initiativtagare är grundforskning verktyg att uttrycka transgener i ett varaktigt och effektivt sätt. S...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna

Här presenterar vi ett protokoll för att främja transgenens integration och produktion av grundaren transgena möss med hög effekt genom en enkel injektion av en lentiviral vektor i det perivitelline utrymmet i en befruktade äggcellen.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Denna metod möjliggör snabb in vivo-screening hos möss, av effekten av en transgen, och är särskilt anpassad för att utföra vinst eller förlust av funktionsstudier, samt ett svar och DNA-motiv kartläggning. Den största fördelen med denna teknik, är att förutsägelseanvändning av transgena djur är över 70%av nyfödda och kan appliceras på någon mus stammar inklusive transgena djur. Efter att ha avlivat mössen, samla in ägggångarna.Till att börja operationen, använd sax för att göra ett stort horisontellt snitt i bukhålan. Sedan, lokalisera oviduct mellan livmodern och äggstocken. Därefter använder böjda tuten för att ta bort mesometrium och membranet med de framträdande blodkärlen.Därefter separerar du äggstocken från äggstocken och dissekerar äggstocken från äggstocken. Sedan bogserbåt på äggraduken och skär bort från livmodern. Överför alla de insamlade oviducts till M2 medium vid rumstemperatur.Vid hantering av ägggångarna, var noga med att undvika att vidröra den svullade ampulla laddad med befruktade ägg. Därefter lägger du till en 100 mikroliterdroppen av hyaluronidase arbetslösning till en 10 centimeters maträtt. Överför sedan de två ägggångarna i den, för att ta bort cumuluscellerna från äggen.Under ett stereomikroskop, använd ett par insulinsprutor för att säkra äggraduken medan du river upp ampulla och sprider de befruktade äggen. Använd sedan en förberedd glaspipett med slangar och ett munstycke för att aspirera alla ägg. Med hjälp av detta verktyg, överföra dem mellan sex droppar M2 medium för att tvätta bort de omgivande cumuluscellerna.Sedan överför de tvättade äggen till en 10 millimeters brunn, i en fyra brunnsplatta, fylld med förvärmd med M16. Sedan överför skålen till en befuktad 37 grader Celsius inkubator. I förberedelse, centrifug den beredda lentiviral vektor suspension vid 160 g i två minuter, att pellet skräpet ofta närvarande i lentiviral lager.I ett säkerhetsskåp av klass två överför du supernatanterna till ett nytt 0,5 milliliterrör. Därefter laddar en mikroliter av supernatant, i en injektionspipett. Fäst sedan injektionspipetten på höger sida mikromanipulater.Och fäst holdingpipetten på vänster sida mikromanipulator. Nu, dispensera åtta mikroliter av M2 medium i mitten av depressionen bilden. Och täck med lätt parafinolja för att undvika avdunstning.Placera sedan 20 ägg i de grunda platserna i droppen utan att skapa bubblor. Se därefter till att spetsen på injektionspipetten är öppen. Om inte, knacka på injektionspipetten med holdingpipetten för att öppna den.Ställ sedan in mikroinjektorn för 20 sekunders injektioner. Nu, med hjälp av innehav pipetten och manuellt tryck aspirera ett befruktat ägg som innehåller två pronuclei och två polära kroppar. Sedan, med hjälp av injektionspipett injicera perivitelline utrymmet i ägget.Rör inte plasmamembranet. Justera trycket så att perivitellinutrymmet fylls med lösning. Trycket bör inte överstiga 600 hekto pascal.Omedelbart efter injicering av de 20 äggen, överför partiet i ett bad av förvärmt M16 medium. Och inkubera dem i minst 30 minuter innan du implanterar dem. 16 timmar efter parning normala honor till hanar med vasektomier, kontrollera för copulation pluggar.Använd dessa honor för implantationen. Därefter gör implantation pipetter med inre diameter på ca 150 mikrometer. Och med flampolerade spetsar som är cirka fyra till fem millimeter långa.Ladda en pipett med embryotestad, lätt parafinolja till strax ovanför axelpunkten. Därefter, aspirera en liten luftbubbla och ytterligare belasta pipetten med M2 medium. Därefter aspirera en andra luftbubbla.Nu, dra upp embryon i pipetten en bakom den andra, minimera volymen av medium mellan embryona. Avsluta, genom att aspirera en mycket liten droppe parafinolja bara ett embryo bred. Beredning av reimplantationspipetten är nyckeln och behöver mycket övning.Ägg i pipetten måste anpassas till praktiskt taget inget medium mellan dem. Nästa, efter sövning musen och bekräftar anestesi med en tå nypa Raka bort två, två centimeter remsor av hår längs ryggmärgen i nivå med det sista revbenet. Nu, placera musen på en värmedyna på ett sterilt fält och drapera den, lämnar ett fönster till den exponerade huden.Därefter sanera den exponerade huden med alternerande scrubs av iodoprovidon och 70 procent etanol. För implantationen, först göra en en centimeter tvärgående snitt, och sedan glida huden i lateralt tills den orange färgade äggstocken är synlig genom kroppen väggen. Därefter gör en fem millimeter snitt med den fina saxen och plocka upp fett pad med en atraumatisk bulldog klämma.När dynan grips, dra ut äggstocken, äggraduken och toppen av livmodern. Därefter lokalisera ampulla och göra en hemisection med vannas scissor, på oviduct segmentet som länkar äggstocken till ampulla. Sedan införa överföringen embryopipett och mata ut äggen.Stannar vid den första luftbubblan efter att äggen har släppts. Har de nödvändiga materialen beredda att upprepa proceduren på den andra oviduct. Och när den är klar, stäng huden upp med sårklämmor.Omedelbart efter stängning av huden injicera intraperitonealy smärtstillande och placera djuret i återhämtningskammaren med ett 39 grader Celsius värmeelement. Övervaka tills den är helt vaken. Transgena djur genererades med den presenterade metoden.En hög titer lentiviral vektorer producerades med hjälp av en 2,3 kilo bas förstärkare för Neurogenin-3 att driva eGFP. Eller som en kontroll, ett fragment av kromosom sex för att driva eGFP. Integrationen i embryon var ganska framgångsrik.Från embryona var bukspottskörteln bud avsnitten och immunostained att leta efter lokaliserade uttryck för eGFP. Över 90 procent av vektorerna, med Neurogenin-3 förstärkare, uttryckt eGFP i Neurog3 uttrycker celler. Ingen av de integrerade kontrollvektorerna uttryckte dock eGFP i bukspottskörtelns knopp.Transgene integrationsställen utvärderades av kvantitativa PCR, med cdx2-genen som kontroll. Det genomsnittliga antalet integrationsplatser var cirka 20 med hjälp av Neurogenin-3-konstruktionen, eller 10 med hjälp av kontrollkonstruktionen. Märkligt nog var den virala transduktionstiter som användes för Neurogenin-3-konstruktionen, ungefär dubbelt så stor som kontrollvektorn.Tyder på ett samband mellan transduktionstitern och antalet integrationer. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man genererar ett stort antal grundare transgena embryon med hjälp av perivitelline injektion av lentiviral vektorer med hög effekt. När behärskar, denna teknik kan producera upp till 50 grundare djur inom en enda dag av mikroinjektion, om det utförs på rätt sätt.Efter detta förfarande, andra metoder som titer pronuclear DNA injektion kan utföras, i syfte att upprätta transgena mus linjer. Glöm inte att arbeta med lentiviral vektorer utsätts för auktorisering från din lokala GMO-kommitté. Dessa vektorer kan vara extremt farliga och försiktighet bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Vildtyp Blockering PCR kombination med direkt sekvensering som en mycket känslig metod för detektion av lågfrekventa somatiska mutationer

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Medierad transformation av OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion och rening av baculoviridae för genterapi ansökan

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

En snabbt Silver färgning protokoll möjliggör enkel och effektiv upptäckt av SSR markörer med en icke-denatureringen polyakrylamidgel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-medierad gen editering av den mänskliga svamp patogener Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...