Name: lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Biz Magali Dumont ve Rolando Meloni lentiviral vektör üretim ve hayvan sırasıyla konut teknik yardım için el yazması ve iVector ve Phenoparc ICM çekirdek eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Institut Universitaire Hospitalo de sinir Translationnelles de tarafından desteklenen Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10 / IAIHU / 06. Alınan Halkla İlişkiler Derneği de Langue Française için finansman dökün l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) ve ortak bir JDRF / INSERM verin.

Hayvan iş dahil tüm yordamlar etik onay almış ve Fransızca Bakanlığı araştırma ve eğitim numarası APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 altında ve 05311.02 tarafından yetkili olmamıştır. PHENOPARC Fransız Tarım Bakanlığı Akreditasyon numarası B75 altında tarafından akredite ICM hayvan tesisi 13 19. Genel iletişim kuralı her yordam özetlenir kesin bir zaman çerçevesi içinde Şekil 1' de gerçekleştirilmesi.
1. hayvan satın alma ve temel b...

<ol>
	<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+(SCID)+mice+carrying+human+cytokine+transgenes.">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li><li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice.">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li><li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse,+rat,+rabbit,+and+pig+genomes.">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li><li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animals:+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine.">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine.">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li><li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors.">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li><li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+are+they+the+future+of+animal+transgenesis.">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li><li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element.">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).</li><li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus.">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li><li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD/scid+background.">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li><li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain.">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li><li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector.">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+generation+of+high-titer,+pantropic+retroviral+vectors:+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes.">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li><li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem/progenitor+cells.">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li><li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas.">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li><li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells.">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).</li><li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV)+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA.">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li><li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+(i-PITT).">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection.">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li><li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection.">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li><li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice.">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li><li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+piggyBac+(PB)+transposon+in+mammalian+cells+and+mice.">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li><li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo.">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li></ol>

Lentiviral vektörler döllü yumurta burada açıklanan perivitelline enjeksiyon transgenik embriyo toplam toplanan embriyo sayısına oranla % 70'den fazla vermiştir transgenik embriyo üretimini sonuçlandı. Bu sonuç önceki raporları ile tutarlı olacak ve özgüllük yordam2,7,10,11,12örneğidir. Önemli özellikleri Tablo 1' de sunu...

Gordon ve ark. öncü çalışmaları 1980 yılında pseudopregnant farelerde implantasyon sonra döllenmiş yumurta plazmid DNA enjeksiyon erkek pronuclei içine entegre transjenik hayvanlar üretimini getirebilecek gösterdi Plazmid DNA1. Transgenik memeliler oluşturulabilir gösteri küresel Yaşam Bilimleri Araştırma temel bilimler ve çevirim Biyomedikal Bilimler için hem de Roman alanlara yol açarak üzerinde çok büyük etkisi vardı. Son dört yıl içinde DNA mikroenjeksiyon rutin bir uygulama haline gelmiştir. Transgenik fareler çok büyük sayıda üretilen rağmen standart yöntem tam olarak tüm fare suşları için kullanılamaz ve zaman alıcı backcrosses2,3gerektirir. Uygulama diğer türler için zorlu4 kalır ve genel transgene tümleştirme verim d. hayvan5birkaç yüzdesine sınırlıdır. Buna ek olarak, transgene tümleştirme etkinliğini pronuclear DNA enjeksiyon zavallı genel verimi açıklayan sınırlayıcı bir faktör temsil eder. Bu açıdan bütünleştirici viral vektörler en verimli araçlar için kargo ve transgenes entegre ve böylece önemli ölçüde entegrasyon verim, bu 10 kb6 aşamaz transgene boyutu olmak tek sınırlama artırmak için yeni araç sağlayabilir .
Lentiviral vektörler ile örtmek protein Vesicular Stomatit virüs (VSV) sözde yazılı pantropic ve son derece bütünleştirici gen transferi araçlardır ve döllenmiş yumurta7transduce için kullanılabilir. Yumurtalar çevreleyen zona pelusida doğal virüs engeldir ve iletim lentiviral vektörler ile izin vermek için geçirilmesi gerekiyor. Transjenik hayvanlar tarafından transducing döllenmiş yumurta mikro delme veya zona pelusida8,9/ kaldırma sonra üretilmedi. Ancak, enjeksiyon perivitelline uzayda zona pelusida altında başlangıçta Lois ve meslektaşları7tarafından tanımlandığı gibi döllenmiş yumurta transduce için en basit yöntem gibi görünüyor.
Perivitelline enjeksiyon lentiviral vektörlerin d. hayvanların % 70 transjenik hayvanlar üretiminde yüksek verim sağlar. Böyle verim standart pronuclei DNA enjeksiyon7,10,11kullanılarak elde edilebilir en iyi verim fazla 10 kat daha yüksektir. Bu bağlamda, en az 50 transgenik kurucuları (F0) enjeksiyonları tek bir oturum oluşturur. Kurucuları çok sayıda, bu nedenle, fenotipleme doğrudan transgenik fare satırları oluşturmak için gerek kalmadan F0 fareler üzerinde gerçekleştirilen transgene etkisi ile uyumludur. Bu avantaj ve in vivo kazanç ve kayıp işlev çalışmaların hafta içinde gerçekleştirmek için özel olarak adapte transgene etkisi hızlı tarama için sağlar. Ayrıca, düzenleyici DNA elemanlarının da hızla arttırıcılar ve transkripsiyon faktörleri11,12' bağlı DNA motifleri eşlemek için taramaya tabi. Pronuclear iğne ile transgenes genellikle benzersiz bir odağı olarak birden çok kopya entegre. Lentiviral vektörler ile tümleştirme, locus10,13başına tek kopya olarak birden çok loci oluşur. Bu nedenle, tümleşik loci çokluğu yeni oluşturulan modeli daha sağlam yapar transgenik kurucuları gözlenen çok yüksek ifade alellerle ilgili olabilir.
Önemlisi, DNA'ın pronuclear enjeksiyon kullanırken, pronuclei görselleştirme işlemi sırasında kesinlikle gereklidir. Bu teknik sınırlama döllenmiş yumurta çok çeşitli fare suşları kaynaklanan kullanımını engeller. Bu nedenle, belirli bir transgenik bir modelde üretim için hangi pronuclei görünmez istenen fare transgene aktarmak için en az 10 ardışık backcrosses ardından izin veren bir yük hayvanlarda üretimini gerektirir zorlanma zorlanma. Lentiviral vektör enjeksiyonları ile perivitelline alanı her zaman görünür ve enjeksiyon çok özel beceri gerektirmez. Örnek olarak, pronuclei enjeksiyon için uygun değildir NOD/SCID transgenik fareler viral vektör enjeksiyonları14ile elde edilmiştir.
Burada, kapsamlı bir protokol transgenik fareler bir hücre sahne embriyo perivitelline uzayda lentiviral vektör enjeksiyonlar kullanarak basit üretim izin için sunulmuştur. İkisinden biri ile kontrollü Transgene ifade her yerde veya hücre belirli Rehberleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
PTrip ΔU3 lentiviral omurga bu çalışma15dakika içinde kullanıldı. Bu vektör içinde U3 sıra kısmen U3 organizatörü etkinliğini kaldırmak ve kendi kendine inactivating bir vektör (günah)16oluşturmak için silinene kadar çoğaltma arızalı lentiviral vektörler üretmek için izin verir. Lentiviral vektör stokları HEK-293T hücre p8.91 kapsülleme plazmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G vesicular Stomatit virüs (VSV) glikoprotein-G17ve pTRIP ΔU3 kodlama ile geçici transfection tarafından üretildi Rekombinant vektör. Detaylı üretim yordamı tamamlayıcı yöntemler sağlanır.
Üretim yüksek titresi lentiviral vektör stoklarının Biyogüvenlik seviye II koşullarda (BSL-2) gerçekleştirilir. Bu BSL-3'te üretilmiş olmalıdır oncogenes dışında çoğu transgenes için geçerlidir. Bu nedenle, üretim BSL-2 koşullarda çoğu için yeterlidir. Buna ek olarak, kullanım ve üretim genellikle çoğu ulusal düzenleyici kurumlar genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO) ile başa çıkmak için kesilir. Çoğaltma beceriksiz günah lentiviral vektörler (aşağıda 2 µg p24 kapsid protein) sınırlı miktarda Fransızca GDO Ajansı ile anlaşma Avrupa Birliği'nin önerileri tarafından açıklandığı gibi BSL-1 koşullar altında kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">PMSG 50UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">G4527</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">hCG 5000UI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">CG5-1VL</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">7982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">4 wells Nunc dish</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">56469</td>
			<td>IVF dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M2 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">M16 medium</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">0,22 &#181;m Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Dutsher</td>
			<td style="width:107px;">146611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Hyaluronidase Enzyme 30mg</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">H4272</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin serynge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-3867</td>
			<td>Terumo Myjector</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">2183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:143px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:107px;">GC 100-10</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Horizontal micropipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">PN-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:107px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">Transferman NK2 5188</td>
			<td style="width:164px;">Hoffman modulation contrast illumination is required</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Celltram air</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Controler of holding pipet</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M8410</td>
			<td>mouse embryo tested</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:229px;">Microinjector</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">Femtojet</td>
			<td style="width:164px;">Can be used to inject DNA or viral vectors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">MC 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">vannas micro scissors</td>
			<td style="width:143px;">Moria</td>
			<td style="width:107px;">9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>centravet</td>
			<td>ISO005</td>
			<td>ISO-VET 100% 250ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">ocrygel</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">OCR002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Povidone iodure</td>
			<td style="width:143px;">centravet</td>
			<td style="width:107px;">VET001</td>
			<td>vetedine 120ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>BUP002</td>
			<td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oneTaq kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0480L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strip of 8 PCR tube</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td>Veriti</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genomic DNA mini kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K1820-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR Master mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4887352001</td>
			<td>SYBR Green&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plate 384</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5217555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">qPCR instrument 384 well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders

Yaklaşık 40 yıldır, pronuclear DNA enjeksiyon transgenes rasgele entegrasyonu ile transgenik fareler oluşturmak için standart yöntem temsil eder. Rutin bir işlem tüm dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır ve kurucusu hayvanlar bir düşük verim içinde kaynaklanan transgene tümleştirme, zavallı etkinliği, onun ana sınırlama bulunur. Sadece birkaç yüzde enjekte döllenmiş yumurta implantasyonu sonra doğan hayvanların transgene entegre etmiş. Buna ek olarak, lentiviral vektörler bütünleştirici gen transferi için güçlü araçlar ve kullanımları döllenmiş yumurta transduce kurucusu yüksek verimli üretim % 70 üzerinde bir ortalama verim ile transgenik fareler sağlar. Ayrıca, herhangi bir fare zorlanma transgenik hayvan üretmek için kullanılabilir ve alellerle transgene ifade son derece yüksek, DNA mikroenjeksiyon karşılaştırıldığında lentiviral aracılı transgenesis ile % 80'i yukarıda. Kargo lentiviral vektör tarafından olabilir DNA parçasının boyutunu 10 kb ile sınırlı ve bu yöntemin büyük sınırlama temsil eder. Basit ve kolay enjeksiyon yordamı döllenmiş yumurta zona pelusida altında gerçekleştirmek kullanarak, 50'den fazla kurucusu hayvanlar mikroenjeksiyon tek bir oturumda üretilebilir. Böyle bir yöntem, doğrudan kurucusu hayvanlar, hızlı kazanç ve kayıp işlev çalışmaların veya ekran genomik DNA bölgeleri kontrol eden ve düzenleyen gen ifade içinde vivoyeteneklerini için gerçekleştirmek için son derece adapte.

Transjenik hayvanlar burada sunulan protokolü kullanılarak oluşturuldu. Temsilcisi her ikisi de her yerde karşımıza çıkan sonuçlar ve hücre türü belirli transgene ifade gösterilmiştir.
Transgenes kurucu ifade
Her yerde Rehberleri transgenes sürekli ve etkin bir şekilde ifade etmek için temel araştırma araçlardır. Böyle Organizatö...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders at JoVE.com

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Bu yöntem farelerde hızlı in vivo tarama sağlar, bir transgen etkisi, ve özellikle kazanç veya fonksiyon çalışmaları kaybı gerçekleştirmek için uyarlanmıştır, yanı sıra bir cevap ve DNA güdü haritalama. Bu tekniğin en büyük avantajı, transgenik hayvanların tahmini kullanımının yenidoğanın %70'inin üzerinde olması ve transgenik hayvanlar da dahil olmak üzere her türlü fare suşlarına uygulanabiliyor olmasıdır. Fareler ötenazi sonra, oviducts toplamak.Ameliyata başlamak için, karın boşluğuna büyük bir yatay kesi yapmak için makas kullanın. Sonra, rahim ve yumurtalık arasında oviduct bulmak. Daha sonra, belirgin kan damarları ile mesometrium ve membran kaldırmak için kavisli forceps kullanın.Daha sonra oviduct'ı yumurtalıktan ayırın ve yumurtalıkları yumurtalıktan ayırın. Sonra, oviduct üzerinde römorkör ve rahim kesip. Toplanan tüm oviduct'ları oda sıcaklığında M2 ortamına aktarın.Oviducts kullanırken, döllenmiş yumurta yüklü şişmiş ampulla dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun. Daha sonra, 10 santimetrelik bir tabağa 100 mikrolitrelik bir damla hyaluronidase çalışma çözeltisi ekleyin. Daha sonra yumurtaküm hücrelerini çıkarmak için içine iki oviducts aktarın.Stereomikroskop altında, ampulla yırtılma ve döllenmiş yumurta dağıtma sırasında oviduct güvenli bir çift insülin şırınga kullanın. Sonra, tüm yumurta aspire etmek için tüp ve ağızlık ile hazırlanmış bir cam pipet kullanın. Bu aracı kullanarak, çevredeki kümülüs hücrelerini yıkamak için m2 orta altı damla arasında aktarın.Daha sonra, yıkanmış yumurtaları 10 milimetrelik bir kuyuya, önceden M16 ile ısıtılmış dört kuyu tabağına aktarın. Daha sonra, bir nemlendirilmiş 37 derece santigrat inkübatör için çanak aktarın. Hazırlık olarak, iki dakika için 160 g hazırlanan lentiviral vektör süspansiyon santrifüj, genellikle lentiviral stok mevcut enkaz pelet.İkinci sınıf bir güvenlik kabininde, süpernatantları yeni bir 0,5 mililitrelik tüpe aktarın. Sonra, bir enjeksiyon pipet içine supernatant bir mikrolitre yükleyin. Daha sonra enjeksiyon pipetini sağ taraftaki mikromanipülatöre takın.Ve tutucu pipeti sol taraftaki mikromanipülatöre takın. Şimdi, depresyon slayt merkezinde M2 orta sekiz mikrolitre dağıtmak. Ve buharlaşmayı önlemek için hafif parafin yağı ile kaplayın.Sonra, kabarcıklar oluşturmadan damla sığ yerlere 20 yumurta yerleştirin. Daha sonra, enjeksiyon pipetucu ucu açık olduğundan emin olun. Değilse, açmak için tutma pipet ile enjeksiyon pipet dokunun.Sonra, 20 saniyelik enjeksiyonlar için mikroenjektör ayarlayın. Şimdi, tutma pipetve manuel basınç kullanarak iki pronüklei ve iki kutup cismi içeren döllenmiş bir yumurtaaspire. Sonra, enjeksiyon pipet kullanarak yumurta perivitelline alan enjekte.Plazma zarına dokunmayın. Basıncı, perivitelline alanının çözeltiyle dolması için ayarlayın. Basınç 600 hecto pascal'ı geçmemelidir.Hemen 20 yumurta enjekte ettikten sonra, önceden ısıtılmış M16 orta bir banyo içine toplu aktarın. Ve yerleştirmeden önce en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Normal dişileri vazektomili erkeklere çiftleştirdikten 16 saat sonra çiftleşme fişleri kontrol edin.Bu dişileri implantasyon için kullan. Daha sonra, yaklaşık 150 mikron iç çapı ile implantasyon pipetler olun. Ve yaklaşık 4-5 milimetre uzunluğunda alev cilalı ipuçları ile.Embriyo test ile bir pipet yükleyin, omuz noktasının hemen üzerinde hafif parafin yağı. Daha sonra, küçük bir hava kabarcığı aspire ve daha fazla M2 orta ile pipet yükleyin. Sonra, ikinci bir hava kabarcığı aspire.Şimdi, embriyoları birbirinin arkasındaki pipete yerleştirin, embriyolar arasındaki ortamın hacmini en aza indirin. Bitirmek, parafin yağı çok küçük bir damla sadece bir embriyo genişliğinde aspire ederek. Reimplantasyon pipetinin hazırlanması çok önemlidir ve çok fazla pratik yapılması gerekir.Pipetteki yumurtalar aralarında neredeyse hiç orta olmayan bir şekilde hizalanmalıdır. Sonra, fare anestezi ve son kaburga düzeyinde omurilik boyunca saç iki santimetre şeritler kapalı iki, iki santimetre saç shave kapalı bir parmak çimdik tıraş ile anestezi doğruladıktan sonra. Şimdi, fareyi steril bir alana bir ısıtma yastığına yerleştirin ve açıkta kalan cilde bir pencere bırakarak onu örtün.Daha sonra, iodoprovidone ve yüzde 70 etanol alternatif scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte. İmplantasyon için, önce bir santimetre lik enine kesi yapın ve sonra turuncu renkli yumurtalık vücut duvarından görünene kadar cildi yanal olarak kaydırın. Sonra, ince makas ile beş milimetrelik bir kesi yapmak ve atravmatik bulldog kelepçe ile yağ yastığı almak.Bir kez yastık kavradı, yumurtalık çekin, oviduct ve rahim üst. Daha sonra, ampulla bulmak ve vannas makas ile bir hemisection yapmak, ampulla yumurtalık bağlayan oviduct segmentinde. Sonra, transfer embriyo pipet tanıtmak ve yumurta fırlatmak.Yumurtalar serbest bırakıldıktan sonra ilk hava kabarcığında durmak. İkinci oviduct üzerinde prosedürü tekrarlamak için gerekli malzemeleri hazırlayın. Ve tamamlandığında, yara klipleri ile deri kapatın.Deriyi kapattıktan hemen sonra, intraperitonealy analjezik enjekte ve 39 derece Santigrat ısıtma elemanı ile kurtarma odasına hayvan yerleştirin. Tamamen uyanana kadar izleyin. Transgenik hayvan sunulan yöntem kullanılarak üretildi.Yüksek bir titer lentiviral vektörler eGFP sürücü Neurogenin-3 için 2.3 kilo baz arttırıcı kullanılarak üretildi. Ya da kontrol olarak, eGFP'yi sürmek için kromozom altının bir parçası. Embriyolara entegrasyon oldukça başarılı oldu.Embriyolardan, pankreas tomurcuk kesitli ve immünostained eGFP lokalize ifade aramak için. Vektörlerin yüzde 90'ından fazla, Neurogenin-3 arttırıcı ile, Neurog3 ifade hücreleri eGFP ifade. Ancak, entegre kontrol vektörleri hiçbiri pankreas tomurcuk eGFP ifade.Transgen entegrasyon bölgeleri, CDX2 geni kontrol olarak kullanılarak kantitatif PCR tarafından değerlendirildi. Entegrasyon sitelerinin ortalama sayısı yaklaşık 20 Neurogenin-3 yapı, ya da 10 kontrol yapısı kullanılarak. İlginçtir, Nörogenin-3 yapısı için kullanılan viral transdüksiyon titre, kontrol vektörünün yaklaşık iki katıydı.Transdüksiyon titreci ile tümleştirme sayısı arasında bir ilişki olduğunu düşündürüyor. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek etkinliği ile lentiviral vektörlerin perivitellin enjeksiyonu kullanarak kurucu transgenik embriyoların çok sayıda oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez hakim, bu teknik mikroenjeksiyon tek bir gün içinde 50 kurucu hayvanlar üretebilir, düzgün yapılırsa.Bu işlemden sonra transgenik fare hatları oluşturmak için titer pronükleer DNA enjeksiyonu gibi başka yöntemler de yapılabilir. Lentiviral vektörlerle çalışmanın yerel GDO komitenizden gelen yetkiye tabi olduğunu unutmayın. Bu vektörler son derece tehlikeli olabilir ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...