Name: injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00
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JHN wird durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF 310030_146290) unterstützt.

Mäuse wurden gezüchtet und gehalten unter spezifischen Pathogen-freies (SPF) in der Tierstation Abteilung Biomedizin, Universität Basel (Basel, Schweiz). Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Eidgenössischen und kantonalen Vorschriften (tierische Protokollnummer 2816 [Kanton Basel-Stadt]) durchgeführt.
1. Vorbereitung des LPS-Lösung
<ol><li>Öffnen Sie den Bestand an LPS von Escherichia coli 0111:B4 unter sterilen Bedingungen gereinigt und rekonstruieren Sie...

<ol>
	<li>Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-bacterial+mutualism+in+the+human+intestine.">Host-bacterial mutualism in the human intestine.</a> Science. 307, 1915-1920 (2005).</li><li>Abreu, M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin+SIGN-R1+has+a+role+in+experimental+colitis+and+responsiveness+to+lipopolysaccharide.">C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide.</a> J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).</li><li>Spadoni, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut-vascular+barrier+controls+the+systemic+dissemination+of+bacteria.">A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria.</a> Science. 350, 830-834 (2015).</li><li>Balmer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+may+act+as+a+firewall+mediating+mutualism+between+the+host+and+its+gut+commensal+microbiota.">The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota.</a> Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).</li><li>Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+bacterial+lipopolysaccharides+with+tissue+macrophages+and+plasma+lipoproteins.">Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins.</a> Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+recombinant+dimeric+TNF+receptor+on+human+inflammatory+responses+following+intravenous+endotoxin+administration.">Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration.</a> J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).</li><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis.">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5, 143-153 (2014).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282, 2085-2088 (1998).</li><li>Hoshino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Toll-like+receptor+4+(TLR4)-deficient+mice+are+hyporesponsive+to+lipopolysaccharide:+evidence+for+TLR4+as+the+Lps+gene+product.">Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product.</a> J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).</li><li>Corral, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lipopolysaccharide+and+cecal+ligation+and+puncture+on+blood+coagulation+and+inflammation+in+sensitive+and+resistant+mice+models.">Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models.</a> Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).</li><li>Shrum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+scoring+system+to+evaluate+sepsis+severity+in+an+animal+model.">A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model.</a> BMC Res Notes. 7, 233 (2014).</li><li>Brandwein, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+colitic+C3H/HeJBir+mice+demonstrate+selective+antibody+reactivity+to+antigens+of+the+enteric+bacterial+flora.">Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora.</a> J Immunol. 159, 44-52 (1997).</li><li>Macpherson, A. J., McCoy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardised+animal+models+of+host+microbial+mutualism.">Standardised animal models of host microbial mutualism.</a> Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice,+Dirty+Mice,+and+Men:+Using+Mice+To+Understand+Human+Immunology.">Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology.</a> J Immunol. 199, 383-388 (2017).</li><li>Wirtz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+lethal+septic+peritonitis+by+neutralizing+the+biological+function+of+interleukin+27.">Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27.</a> J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).</li></ol>

Dieses Protokoll imitiert immunologische Prozesse, die nach der Invasion durch mikrobielle gewonnenen Erzeugnissen auftreten. Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind die Auswahl der mauslinie, den Hygienestatus der Mäuse, die Dosis von LPS, die Überwachung der Tiere für das Auftreten von endotoxämie und der Zeitpunkt der Beendigung des Experiments. Am wichtigsten ist, ist der genetische Hintergrund der Maus Belastung zu berücksichtigen. Verschiedene Mausstämme haben unterschiedliche Anfälligkeit für LPS. ...

Der menschliche Darm ist mit ein großes Konsortium von Mikroorganismen besiedelt, die die Mikrobiota bildet, die eine für beide Seiten vorteilhafte Beziehung mit dem Host während der Evolution entwickelt hat. In dieser Beziehung stellt der Host eine sichere Nische für die Mikrobiota, während die Mikrobiota liefert Vitamine, Nährstoffe Verdauung und Schutz vor Krankheitserregern, Host, wo die Mikrobiota1befindet. Wenn diese vorteilhafte Beziehung zwischen dem Host und dem Mikrobiota gestört ist, können Krankheiten entstehen, wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen (IBD). IBD ist eine multifaktorielle chronisch-entzündliche Erkrankung des Darms verursacht durch genetische Faktoren und Umweltfaktoren, die in zwei Hauptformen, Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) auftreten. Trotz Ähnlichkeiten zwischen den beiden Formen der IBD zeichnen sie sich durch gewisse Unterschiede in der Lage und Art der entzündlichen Veränderungen. CD ist eine rezidivierende Transmural entzündliche Erkrankung, die potenziell zu, zu jedem Teil des Magen-Darm-Trakt, verlängern kann während UC nicht Transmural ist und ist auf den Dickdarm beschränkt. Darüber hinaus ist Mutationen im Nukleotid-Bindung Oligomerisierung Domäne-haltige Protein 2 (NOD2), einen Muster-Anerkennung-Rezeptor (PRR), die einer Dipeptid (MDP), eine Komponente der Zellwand der meisten gram-positiven und -negativen Bakterien, erkennt CD2zugeordnet. Darüber hinaus wurden Listerien und Streptokokken , Escherichia coli (E. Coli)und ihre Produkte Alle innerhalb von Makrophagen in Patienten mit Zervikaler gefunden, die den Host eingegeben haben, nachdem eine Barriere gegen3. Wenn Bakterien oder deren Produkte die Gastgeber bei der Entwicklung der CD eingeben, entwickelt das Immunsystem eine Reaktion führt zu die Produktion von zirkulierenden Antikörper Anti-bakterielle4. Vielleicht rührt der überzeugendste Beweis für die Rolle der Mikrobiota in der Pathogenese der IBD Mausmodellen. Wenn Tiere mit Antibiotika behandelt werden, oder wenn Mäuse in steriler (GF) gehalten werden, wird die Schwere der Erkrankung bei den meisten Modellen der Kolitis, wie IL-10-/-Mäusen reduziert, die nicht Kolitis in GF Einrichtungen5,6 entwickeln. Ulcerosa stört darüber hinaus auch die Zusammensetzung der Mikrobiota, zeichnet sich durch eine unausgewogene Zusammensetzung und reduzierte Reichtum Dysbiose7genannt. Die Folge der IBD kann eine erhöhte intestinale Permeabilität, die bis zum Eingang der Mikroben und mikrobielle gewonnenen Erzeugnisse in die Host-führen können.
Bei Tieren induziert die Anwendung von Dextran Natriumsulfat (DSS) eine intestinale epitheliale Verletzung führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit der die epitheliale Barriere-8. Portal-LPS-Konzentrationen sind bei Tieren mit DSS ulcerosa9erhöht. Interessanterweise sind Tiere fehlt die C Typ Lektin-Rezeptor spezifischen intrazellulären Adhäsion Molekül-3 greifen Nonintegrin Homolog-bezogene 1 (Zeichen-R1) von DSS Kolitis und LPS-induzierte endotoxämie10geschützt. Weiter in die Host-zu verbreiten, müssen Bakterien und Bakterienprodukte abgeleitet die vaskuläre Barriere11, der Bauchhöhle, in dem die dünn- und Dickdarm befindet, die mesenterialen Lymphknoten und/oder der Leber12. Um die Komplexität dieses Systems zu verringern, wurde eine definierte bakterielle abgeleitete Verbindung verwendet. LPS, wodurch endotoxämie nach intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) Injektion13 in Mäuse, der Ausdruck der Interleukine Il6 und Ilb und Zytokin Tnfa als Reaktion auf LPS studieren injiziert wurde.
LPS ist ein Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) ausgedrückt als Zellwand Bestandteil von Gram-negativen Bakterien, die aus Lipid A besteht (die wichtigsten PAMP in der Struktur der LPS), eine Core-Oligosaccharid und ein O Seite Kette14. Abgabe-wie Empfänger 4 (TLR4) zum Ausdruck gebracht durch Dendritische Zellen, Makrophagen und Epithelzellen erkennt LPS15, das Co-Rezeptoren für entsprechende Bindung erfordert. Die akute Phase Protein LPS-bindendes Protein (LBP) bindet LPS zu einem Komplex, der LPS mit dem Cluster der Differenzierung 14 (CD14), eine glycosylphosphatidylinositole verankert Membranprotein überträgt. CD14 weitere shuttles LPS auf Lymphozyten Antigen 96 oder auch bekannt als MD-2, die die extrazelluläre Domäne des TLR4 zugeordnet ist. Die Bindung des LPS an MD-2 erleichtert die Dimerisierung von TLR4/MD-2 induzieren Konformationsänderungen intrazellulären Adapter Moleküle Aktivieren der nachgeschalteten Signal Weg14, umfasst die primäre myeloische Differenzierung zu rekrutieren Antwort gen 88 (MyD88) - abhängigen Signalweg und die TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE) - abhängigen Weg16. Die Anerkennung der LPS von TLR4 dann die NF-κB-Signalweg aktiviert und induziert die Expression von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF, IL-6 und IL-1β17.
Insbesondere wenn LPS in Tiere, die Konzentration von LPS gegeben zu den Tieren injiziert ist der genetische Hintergrund des Tieres und der Ernährung zu berücksichtigen. Hohe Konzentrationen von LPS führt zu einem septischen Schock, Hypotonie und mehrere Orgel Ausfälle geprägt und schließlich zum Tod18. Mäuse sind unempfindlicher gegen LPS im Vergleich zu Menschen, wo LPS Konzentrationen zwischen 2-4 ng/kg Körpergewicht (BW) in der Lage, ein Cytokine Sturm19zu induzieren. Bei Mäusen, die letale Dosis (LD50), die Tod in der Hälfte der Mäuse reicht von 10-25 mg/kg BW20 abhängig von der Maus-Sorte verwendet induziert. Für die gängigen Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c, ist die letale Dosis 50 % (LD50) 10 mg/kg kg. Im Gegensatz dazu sind die Stämme C3H/HeJ und C57BL/10ScCr von LPS induzierte endotoxämie, geschützt, die durch Mutationen im Tlr4-21. Infolgedessen sind Tlr4-defizienten Mäusen Hyporesponsive Injektionen mit LPS22. Anderen gentechnisch veränderten Mauslinien, z. B. PARP1/Mäuse23 sind resistent gegen LPS-induzierten toxischen Schock.
Die Maus-Modell beschrieben verwendet hier eine subletale Dosis von LPS systemisch verabreicht, um die Folgen der LPS Verbreitung nach einer Verletzung der Barriere von der Körperoberfläche zu imitieren. Die gewählte LPS-Konzentration (2 mg/kg kg) nicht Mortalität bei C56Bl/6-Mäusen, aber die induzierte Freisetzung von Pro-inflammatorischen Zytokinen induzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td>
			<td style="width:303px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:119px;">K1081</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit,</td>
			<td style="width:303px;">Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-Free DNase Set,</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnican 50 Single-use insulin syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany</td>
			<td>9151125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Mikro 220R</td>
			<td>Hettich, Kirchlengern, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td>Aesculap, Tuttlingen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td>
			<td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI Reagent</td>
			<td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td>
			<td>R2050-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of lipopolysaccharide into mice to mimic entrance of microbial-derived products after intestinal barrier breach

Die intestinale epitheliale Barriere trennt den Host von der Mikrobiota, die normalerweise toleriert oder ignoriert wird. Der Verstoß gegen diese Barriere führt im Eingangsbereich der Bakterien oder Bakterien gewonnenen Erzeugnisse in die Host-Zugriff auf die Host-Zirkulation und inneren Organe führt zu einer unkontrollierten Entzündung wie bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beobachtet, die zeichnen sich durch eine erhöhte intestinale epitheliale Durchlässigkeit.
Um den Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen in die Host-zu imitieren, ein endotoxämie Modell in welcher Lipopolysaccharid (LPS), eine Komponente der äußeren Zellwand von gramnegativen Bakterien übernommen wurde, wurden in Mäuse injiziert. In dieser Studie eine subletale Dosis von LPS intraperitoneal injiziert wurde und die Mäuse wurden anschließend für 8 h über eine Krankheit Punktzahl überwacht. Darüber hinaus der Ausdruck, den Ebenen von inflammatorischen Zytokinen Il6, Il1b, und Tnfa qPCR zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der Milz, Leber und Darm analysiert wurden Posten LPS Injektion. Dieses Modell könnte für die Studien, die Untersuchung der Immunantwort nach der Invasion von Mikroorganismen oder Bakterien stammenden Produkte verursacht durch eine Barriere Verletzung von Körperoberfläche nützlich sein.

Um die Folgen für den Host nach dem Eintritt von Bakterien oder bakterielle abgeleitete Produkte zu imitieren, die nach Darmbarriere Verletzung auftritt, LPS in C57Bl/6 Mäusen in subletalen Dosen (2 µg/g Körpergewicht) injiziert wurde. Jeder Mausklick wurde überwacht und erzielte für das Auftreten von endotoxämie mit Parametern im Notenblatt, das enthält, das Erscheinungsbild der Mäuse, die Aktivität der Tiere, den Zustand der Augen, die Atemfrequenz und die Qualität (T...

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Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

Hier präsentiert sich ein Protokoll zum Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren. Eine niedrige subletale Dosis von Lipopolysaccharid injiziert wurde systemisch in Mäuse, die 24 h nach der Injektion beobachtet wurden. Der Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in Milz, Leber und Darm bestimmt.

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

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There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Mechanistische Einblicke in die Entwicklung von TNBS-vermittelter Darmfibrose und Bewertung der hemmenden Wirkungen von Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Derived Exosomes

Differentiation of Monocytes into Phenotypically Distinct Macrophages After Treatment with Human Cord Blood Stem Cell CB-SC-Derived Exosomes

Differenzierung von Monozyten in phänotypisch ausgeprägte Makrophagen nach der Behandlung mit humanen Cordblutstammzellen (CB-SC)-Abgeleitete Exosomen

Stem Cell Educator (SCE) therapy is a novel clinical approach for the treatment of type 1 diabetes and other autoimmune diseases. SCE therapy circulates ...