Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

ونشكر الدكتور ألكسندر مروة على تعليقاته على المخطوطة. بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحث (ANR الملز 2011 003 01؛ ANR-15-CE16-0010 والوكالة الوطنية للمعلومات-17-CE37-0010-03)، رقم معتمد من قبل الزمالة من صب مؤسسة بحوث sur la الزهايمر. ونحن نشكر مرفق الحيوان من إيببس (باريس، فرنسا).

جميع إجراءات تجريبية باستخدام الحيوانات تم تنفيذها طبقاً للوائح الفرنسية (رمز الريف R214/87 إلى R214/130) وتتفق مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية للجماعة الاقتصادية الأوروبية (86/609/EEC) والميثاق الوطني الفرنسي على أخلاقيات التجارب الحيوانية. كافة البروتوكولات أقرته لجنة الأخلاقيات تشارلز داروين وق...

وحيد الخلية متعدد RT-PCR بعد التصحيح-المشبك يمكن موثوق بها وفي الوقت نفسه التحقيق أكثر من 30 من الجينات في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة يتطلب كفاءة عالية [بكر] كبسولة تفجير. واحدة من الخطوات التي تحد آخر جمع لمحتوى ا?...

قشرة الدماغ وتضم العديد من أنواع الخلايا في مختلف العمليات الفسيولوجية. على تحديد وتوصيف، شرطا أساسيا لفهم وظائفها المحددة، يمكن أن تكون صعبة للغاية نظراً لتنوع المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية الكبيرة التي تتسم بها أنواع الخلايا القشرية1 ،2،،من34.
خلية واحدة متعدد RT-PCR يستند إلى المزيج من التصحيح-المشبك وتقنيات RT-PCR. ويمكن التحقيق في وقت واحد أكثر من 30 من الجينات المعرفة مسبقاً في الخلايا التي تم تحديدها اليكتروفيسيولوجيكالي5. إدراج الراسم العصبية في ماصة تسجيل زيادة يسمح توصيف الخصائص المورفولوجية للخلايا مسجل بعد الوحي histochemical6،،من78،9، 10. وأسلوب مفيدة جداً لتصنيف أنواع الخلايا العصبية على أساس تحليل متعدد المتغيرات لتلك الصفات المظهرية5،،من910،11،12 ،،من1314. خلية مفردة متعدد RT-PCR هو أيضا مناسبة لتوصيف الخلايا غير العصبية مثل أستروسيتيس15،،من1617، ويمكن تطبيقها عمليا على كل الدماغ بنية18، 19،20،21،22،23 وخلية نوع، على افتراض أنها يمكن أن تسجل في تكوين كل خلية.
هذا الأسلوب مريحة للغاية لتحديد مصادر الخلوية و/أو أهداف لانتقال أنظمة7،8،15،16،،من2021، 24،25،26،،من2728، لا سيما عندما لا توجد أجسام مضادة محددة. فإنه يعتمد على تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا المحددة بصريا29، ومما يسمح أيضا لاستهداف الخلايا في15،،من8بيئة خلوية خاصة16. وعلاوة على ذلك منذ سيتوارتشيتيكتوري أنسجة الدماغ محفوظاً في شرائح المخ، كما يتيح هذا النهج دراسة العلاقات التشريحية للخلايا تتميز بعناصر الخلايا العصبية وغير العصبية7،8 , 18.
نظراً لهذه التقنية محدودة بمبلغ المقطوع السيتوبلازم وكفاءة الرايت، الكشف عن مرناً المعرب عنها في عدد نسخ منخفضة يمكن أن يكون صعباً. على الرغم من أن النهج الأخرى القائمة على التكنولوجيا رناسيق تسمح لتحليل الترنسكربيتوم كله من خلايا مفردة3،4،،من3031، يحتاجون التعاقب مكلفة الفائق ليس بالضرورة متاح لكل مختبر. حيث يستخدم تقنية RT-PCR متعدد خلية مفردة بكر نقطة النهاية، فإنه يتطلب فقط ثيرموسيكليرس متاحة على نطاق واسع. يمكن أن توضع بسهولة في مختبرات مجهزة بالهياكل الكهربية ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. يمكن ذلك، خلال يوم واحد، توفير تحليل نوعي للتعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات. وهكذا، هذا النهج يوفر سهولة وصول إلى توصيف الجزيئية للخلايا المفردة بطريقة سريعة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

قشرة الدماغ يتكون من العديد من أنواع الخلايا نستعرض مختلف السمات المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية. ويعوق هذا التنوع من السهل تحديد وتوصيف هذه الأنواع الخلية، شرطان أساسيان لدراسة مهامهم المحددة. توضح هذه المقالة خلية مفردة متعدد النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR) البروتوكول، الذي يسمح، بعد التصحيح-المشبك تسجيل شرائح، كشف في نفس الوقت التعبير عن عشرات الجينات في خلية واحدة. هذه طريقة بسيطة يمكن تنفيذها مع توصيف الخصائص المورفولوجية وقابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الصفات المظهرية لمختلف أنواع الخلايا وبيئتها الخلوية خاصة، مثل القرب من الأوعية الدموية. مبدأ هذا البروتوكول هو لتسجيل نسخ خلية مع تقنية المشبك التصحيح، الحصاد وعكس محتواه هيولى، والكشف عن نوعي متعدد التعبير عن مجموعة معرفة مسبقاً من الجينات ببكر. أنه يتطلب تصميم دقيق [بكر] كبسولة تفجير وحل المشبك التصحيح داخل الخلايا متوافق مع RT-PCR. للتأكد من نسخة انتقائية وموثوق بها يتطلب الكشف، هذا الأسلوب أيضا ضوابط ملائمة من حصاد السيتوبلازم إلى خطوات التضخيم. على الرغم من الاحتياطات التي نوقشت هنا يجب أن يتبع تماما، يمكن استخدام تقريبا أي المختبر الكهربية الخلية واحد متعدد تقنية RT-PCR.

ويرد في الشكل 3عملية تحقق من صحة ممثل متعدد RT-PCR. تم تصميم البروتوكول للتحقيق في نفس الوقت التعبير عن 12 جينات مختلفة. VGluT1 الناقل غلوتامات حويصلية اتخذ كعنصر إيجابي ل الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك42. واستخدمت كعلامات جابايرجيك إينتيرنيورونس<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

ويصف هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة والاحتياطات المطلوبة لأداء متعدد النسخ العكسي خلية مفردة البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك. هذا الأسلوب أسلوب بسيط وفعال لتحليل الشخصية التعبير لمجموعة محددة سلفا من المورثات من خلية واحدة تتميز بتسجيلات المشبك التصحيح.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...