Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
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Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).

Alle experimentelle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit französischen Regelungen (Code Rural R214/87 bis R214/130) und entsprach den ethischen Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (86/609/EWG) und der französischen Nationalcharta über die Ethik von Tierversuchen. Alle Protokolle wurden von Charles Darwin-Ethik-Kommission genehmigt und dem französischen Ministerium für Bildung und Forschung (Genehmigung 2015 061011367540) vorgelegt. Die IBPS Tie...

Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten ...

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.
Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.
Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.
Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.

Eine repräsentative Validierung der Multiplex-RT-PCR ist in Abbildung 3dargestellt. Das Protokoll wurde entwickelt, um gleichzeitig die Expression von 12 verschiedenen Genen Sonde. Die vesikuläre Glutamat Transporter vGluT1 wurde als Positivkontrolle für glutamatergen Neuronen42übernommen. Die GABA-Synthese von Enzymen (GAD65 und GAD-67), NEUROPEPTID Y (NPY) und Somatostatin (SOM) dienten als Marker der Gabaergen Interneuronen<sup ...

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...