Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

אנו מודים ד ר אלכסנדר Mourot על דבריו על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 ו- ANR-17-CE37-0010-03), בניין נתמך על-ידי אחוות מ Fondation pour la רשרש סור אלצהיימר. אנו מודים את המתקן בעלי חיים IBPS (פריז, צרפת).

כל ההליכים ניסיוני באמצעות בעלי חיים היו שבוצעה על פי תקנות צרפתי (קוד כפריים R214/87 כדי R214/130), תאמו את ההנחיות האתית של האמנה הלאומית הצרפתית והן בקהילה הכלכלית האירופית (86/609/EEC) על האתיקה של ניסויים בבעלי חיים. כל הפרוטוקולים היו אושרו על ידי ועדת האתיקה צ'ארלס דרווין, נאספו צרפתית משרד חינוך...

יחיד תא מולטיפלקס RT-PCR לאחר תיקון-קלאמפ יכול בו זמנית ובאמינות לחקור את הביטוי של גנים יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5. ניתוח ביטוי גנים ברמת תא בודד דורש תחל PCR יעילים ביותר. אחד הצעדים המגביל ביותר הוא אוסף של תוכנו של התא. היעילות שלה תלוי הקוטר של קצה פיפטה תיקון, אשר חייב לה?...

קליפת כוללת סוגי תאים רבים המעורבים בתהליכים פיזיולוגיים שונים. זיהוי ואפיון שלהם, תנאי הכרחי להבנה של הפונקציות הספציפיות שלהם, יכולה להיות מאוד מאתגרת בהתחשב גדול מורפולוגי, הפיזיולוגית המולקולריים הרב גוניות המאפיינת את סלולרי קורטיקלית סוגים1 ,2,3,4.
תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מבוססת על השילוב של תיקון-קלאמפ וטכניקות RT-PCR. זה יכול לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים מוגדרים מראש יותר מ-30 תאים מזוהה electrophysiologically5 ההכללה של מכשיר מעקב עצביים ב ההקלטה פיפטה נוספת מאפשרת אפיון מורפולוגי של התאים מוקלט אחרי התגלות פתולוגיה6,7,8,9, 10. זאת שיטה מאוד שימושי עבור הסיווג של סוגי עצביים מבוסס על ניתוח רב משתני שלהם תכונות פנוטיפי5,9,10,11,12 13, ,14. תא בודד מולטיפלקס RT-PCR מתאים גם אפיון תאים שאינם עצביים כגון האסטרוציטים15,16,17, ולא ניתן להחיל כמעט על כל המוח מבנה18, 19,20,21,22,23 תא וסוג, בהנחה שהם ניתן להקליט בתצורה של כל תא.
טכניקה זו היא מאוד נוח עבור זיהוי מקורות הסלולר ו/או מטרות של שידור מערכות7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, במיוחד כאשר נוגדנים ספציפיים חסרים. זה מסתמך על תיקון-קלאמפ הקלטות של תאים שזוהה באופן חזותי29, ובכך מאפשר גם את המיקוד של תאים ב-15,8,16בסביבה התאית הספציפית. יתר על כן מאז cytoarchitecture של רקמת המוח נשמר פרוסות המוח, גישה זו גם מאפשרת חקר הקשרים האנטומי של התאים מאופיין עם אלמנטים שאינם עצבית עצביים7,8 , 18.
מאז בטכניקה זו הוא מוגבל לפי כמות הציטופלסמה שנקטפו ועל ידי יעילות RT, הגילוי של mRNA באה לידי ביטוי במספר עותק נמוך יכול להיות קשה. למרות גישות אחרות מבוסס על טכנולוגיית RNaseq לאפשר לנתח את כל transcriptome של תאים בודדים3,4,30,31, הם צריכים תפוקה גבוהה סקוונסרים יקר. לא בהכרח זמין בכל מעבדה. מאז הטכניקה RT-PCR תא בודד מולטיפלקס משתמשת מובילים PCR, זה רק דורש thermocyclers הנפוצה. זה יכול להתפתח בקלות במעבדות מצויד אלקטרופיזיולוגיות set-ups, לא דורשת ציוד יקר. זה יכול לספק, בתוך יום אחד, ניתוח איכותי של הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים. לפיכך, גישה זו מציעה גישה נוחה אפיון מולקולרי תאים בודדים בצורה מהירה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

קליפת המוח מורכב סוגי תאים רבים מפגין תכונות מורפולוגיות, הפיזיולוגית מולקולרית שונות. המגוון הסלים קל זיהוי ואפיון אחד מסוגי התאים, תנאים מוקדמים ללמוד הפונקציות הספציפיות שלהם. מאמר זה מתאר תא בודד מולטיפלקס שעתוק במהופך פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) הפרוטוקול, המאפשר, לאחר תיקון-קלאמפ הקלטה לפרוסות, כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של עשרות גנים בתא יחיד. שיטה זו פשוטה ניתן ליישם עם אפיון מורפולוגי, והוא החלים נרחב כדי לקבוע את התכונות פנוטיפי של סוגי תאים שונים ועם סביבתם הסלולר מסוים, כמו למשל בקרבת כלי דם. העיקרון של פרוטוקול זה היא כדי להקליט תא עם הטכניקה תיקון-קלאמפ, כדי לקצור ולהפוך לתמלל את התוכן cytoplasmic שלה, כדי לזהות איכותית הביטוי של ערכה מוגדרת מראש של גנים על ידי מגה-פלקס PCR. זה דורש עיצוב זהיר של PCR תחל והפתרון תיקון תאיים-קלאמפ תואמת ל- RT-PCR. כדי להבטיח תעתיק סלקטיבי ואמין זיהוי, טכניקה זו מחייבת גם הפקדים המתאימים הציטופלסמה הקטיף לצעדים הגברה. למרות אמצעי הזהירות שנדונו כאן חייב להיות במעקב בלבד, כמעט כל מעבדה אלקטרופיזיולוגיות באפשרותך להשתמש התא הבודד מולטיפלקס בטכניקת RT-PCR.

אימות נציג של מולטיפלקס RT-PCR מוצג באיור3. הפרוטוקול תוכנן כדי לחקור בו זמנית את הביטוי של גנים שונים 12. VGluT1 טרנספורטר גלוטמט vesicular נלקח בתור פקד חיובי עבור הנוירונים glutamatergic42. גאבא סינתזה אנזימים (GAD65 ו- 67 גד), Neuropeptide Y (NPY) ו Somatostatin (סום) שימשו כסמני...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...